СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ СОМАТОТРОПИНА Российский патент 1997 года по МПК C07K1/30 C12P21/00 C12N15/18 

Описание патента на изобретение RU2099348C1

Изобретение в целом относится к способам выделения рекомбинантных белков в частности к способу выделения рекомбинантных белков из белковых растворов, содержащих высокомолекулярные загрязняющие белки.

Способы получения рекомбинантных белков хорошо известны, так гетерологичные сегменты ДНК, кодирующие конкретный белок, с помощью методов биотехнологии внедряют в микроорганизмы-хозяева. Выращиванием микроорганизмов-трансформантов в условиях, индуцирующих экспрессию белков, можно получить такие гетерологичные белки, как инсулин, соматотропины, интерлейкины, интерфероны, соматомедины и т.п.

К сожалению, гетерологичные белки, продуцируемые микроорганизмами-трансформантами, часто биологически неактивны, поскольку такие белки не совпадают с соответствующей третичной структурой при их транскрибировании в микроорганизме. Гетерологичные белки имеют тенденцию к образованию агрегатов, распознаваемых в клетках как "тела включения". Такие тела включения могут также возникнуть в результате образования ковалентных межмолекулярных дисульфидных связей, которыми нескольо белковых молекул связываются друг с другом с образованием нерастворимых комплексов. Тела включения, как правило, содержат в основном гетерологичные белки и небольшую долю загрязняющих белков микроорганизма-хозяина.

Создано несколько способов извлечения из микроорганизмов тел включения и превращения содержащихся в них гетерологичных белков в белки с нативной биоактивностью, сопоставимой с активностью родственных природных или нерекомбинантных белков. Такие способы обычно включают разрушение клеток микроорганизма, отделение тел включения от клеточных осколков, солюбилизацию белковых тел включения в денатуранте-детергенте, освобождающем белок, отделение гетерологичных белков тел включения от нерастворимых примесей, удаление денатуранта-детергента с восстановлением в результате гетерологичным белком биоактивной третичной конформации и отделение белка от остающихся в растворе загрязняющих белков.

Известно несколько схем очистки рекомбинантного белка с применением указанных общих процедур: патенты США NN 4511503 и 4518526 (01son и др.) и патенты США NN 4511502 и 4620948 (BuiIoer и др.) раскрывают многостадийные способы, в которых (1) тела включения солюбилизируют в сильном денатуранте и восстановителе, (2) нерастворимые примеси удаляют из раствора солюбилизированного белка, (3) сильный денатурант заменяют слабым денатурантом, (4) осуществляют распрямление белка путем окисления сульфгидрильных групп до дисульфидных связей с применением молекулярного кислорода и катализатора, обычно катионов металлов и тетратионата натрия, и (5) отделяют белок от других загрязняющих белков с помощью методов разделения на мембранах или хроматографическими методами.

В патенте США N 4677196 (Rausch и др.), приводимом здесь в качестве ссылки, раскрывается конкретный способ очистки и активирования белков, являющийся вариацией вышеприведенной общей схемы. Способ включает солюбилизацию тел включения в НДС, удаление избытка НДС из раствора с помощью диализа или иной приемлемой процедуры, хроматографирование раствора белка в НДС на задерживающей ионы смоле и хроматографирование полученного раствора на анионообменной смоле с выделением белка.

Всем таким известным методикам присуща общая проблема. Раствор белка, полученный после удаления денатуранта-детергента, содержит рекомбинантный белок, низкомолекулярные загрязняющие белки, небелковые примеси и высокомолекулярные белковые примеси, при этом высокомолекулярные белковые примеси часто в основном представлены димерами, олигомерами и агрегатами рекомбинантного белка, но также включают нерекомбинантные белки от гидролиза клетки. Часто отделение рекомбинантного белка от указанных примесей, в частности димеров, олигомеров и агрегатов рекомбинантного белка достигается с трудом, требует времени и дорого. Методы хроматографии и разделения на мембранах могут оказаться эффективными при отделении белка от примесей, но такие методы громоздки, длительны, дорогостоящи и часто приводят к низкому процентному выходу выделения белка.

Таким образом, существует необходимость в новых улучшенных способах простого, быстрого и недорогого выделения с высокими выходами рекомбинантного белка из растворов, содержащих высокомолекулярные белковые примеси.

Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в создании нового способа простого, быстрого и недорогого выделения с высокими выходами рекомбинантных белков из белковых растворов, содержащих высокомолекулярные примесные белки.

Другая цель настоящего изобретения заключается в создании способа удаления высокомолекулярных примесных белков из раствора рекомбинантного белка, что в результате позволяет легко, быстро и недорого выделить рекомбинантный белок.

Эти и другие цели изобретения достигают непосредственным добавлением солей металла IIA Группы к раствору, содержащему высокомолекулярные примесные белки и рекомбинантный белок в количестве, достаточном для селективного осаждения высокомолекулярных белковых примесей. Соли индуцируют преимущественное осаждение белков с молекулярной массой, примерно в полтора раза превышающей молекулярную массу рекомбинантного белка, в частности димеры, олигомеры и агрегаты рекомбинантного белка. Осадок отделяют от раствора с оставлением в растворе рекомбинантного белка, низкомолекулярных примесных белков и других небелковых примесей. Рекомбинантный белок выделяют из раствора известными методами и его обработкой получают целевой белковый продукт.

В рекомендуемом воплощении изобретения соли металла IIА Группы добавляют непосредственно в раствор в количестве, достаточном для создания 0,1-10%-го (об) раствора. Высокомолекулярные примесные белки осаждаются, и их удаляют из раствора обычными способами, такими как фильтрование, центрифугирование и т. п. Полученный белковый раствор, содержащий рекомбинантный белок, низкомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси, подвергают дальнейшей обработке с помощью обычных процедур, например хроматографии с выделением рекомбинантного белка.

Другие цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания изобретения.

Термином "рекомбинантный белок" в применяемом здесь значении обозначается белок, полученный рекомбинантными методами, который хотят выделить в сравнительно чистом виде, в том числе белки с аминокислотной последовательностью нативных белков и их аналогов и мутеинов, характеризующиеся замещенной, подвергнутой делеции, заменной или иным способом модифицированной последовательностью.

Термин "рекомбинантный соматотропин" (рСТ) в применяемом здесь значении включает рекомбинантные белки с аминокислотной последовательностью нативного соматотропина, аминоксилотной последовательностью, по существу аналогичной последовательности нативного соматотропина или укороченной последовательностью, а также их аналоги и мутеины, характеризующиеся замещенной, подвергнутой делеции, замененной или иным образом модифицированной последовательностью. В частности, рСТ в применяемом здесь значении включает белок с той же самой последовательностью, что и у нативного соматотропина (СТ), но в которой аминокислоты амино-окончания подвергнуты делеции. Примеры подобных белков включают, но без ограничения только ими: рекомбинантный дельта-7- соматотропин свиньи, рекомбинантный дельта-4-соматотропин коровы и т.п.

Термин "высокомолекулярные примесные белки" или "высокомолекулярные белковые примеси" в применяемом здесь значении относится к белкам с молекулярной массой, примерно 1,5 раз превышающей молекулярную массу рекомбинантного белка, в частности к димерам, олигомерам и агрегатам рекомбинантного белка, чья молекулярная масса примерно вдвое превышает молекулярную массу рекомбинантного белка.

Термином "низкомолекулярные примесные белки" или "низкомолекулярные белковые примеси" в применяемом здесь значении обозначаются белки с молекулярной массой примерно в 1,5 раз ниже молекулярной массы рекомбинантного белка.

Термин "небелковые примеси" в применяемом здесь значении относится к сравнительно низкомолекулярным веществам, таким как осадители, солюбилизирующие средства, окислители, восстановители и т.п. обычно присутствующих в белковых растворах.

Согласно настоящему изобретению, дается способ выделения рекомбинантного белка из белкового раствора, содержащего высокомолекулярные примесные белки. Способ заключается в непосредственном добавлении солей металла IIА Группы к раствору, содержащему высокомолекулярные примесные белки и рекомбинантный белок в количествах, достаточных для селективного осаждения высокомолекулярных белковых примесей. Соли металла IIА Группы преимущественно индуцируют осаждение белков, чья молекулярная масса примерно в 1,5 раза превышает молекулярную массу рекомбинантного белка, в частности димеров, олигомеров и агрегатов рекомбинантного белка, молекулярная масса которых примерно в 2 раза превышает молекулярную массу рекомбинантного белка. Способ представляет собой улучшенный способ легкого, быстрого и недорогого выделения с высокими выходами рекомбинантных белков из растворов, содержащих высокомолекулярные белковые примеси.

В рекомендуемом воплощении изобретения дается способ выделения рекомбинантных соматотропинов (молекулярная масса примерно 20000) непосредственным добавлением солей металла IIА Группы к растворам, содержащим высокомолекулярные примесные белки и рекомбинантные соматотропины в количествах, достаточных для селективного осаждения высокомолекулярных белковых примесей. Соли металла IIА Группы преимущественно индуцируют осаждение белков с молекулярной массой, примерно в 1,5 раз превышающей молекулярную массу рекомбинантного соматотропина (с молекулярной массой более чем примерно 30000), в частности димеров, олигомеров и агрегатов рекомбинантного соматотропина (молекулярная масса примерно 40000 и выше). Таким образом, настоящий способ представляет собой способ отделения рекомбинантного соматотропина от его биологически неактивных димеров, олигомеров и агрегатов.

Растворы, содержащие рекомбинантный белок, небелковые примеси, высокомолекулярные белковые примеси и низкомолекулярные белковые примеси и применимые в настоящем изобретении, получают хорошо известными методами. Как правило, белковые тела включения, продуцированные рекомбинантными микроорганизмами, обрабатывают с удалением липидов и клеточных осколков, и полученные сравнительно чистые тела включения, содержащие рекомбинантный белок и примесные белки, в частности высокомолекулярные димеры, олигомеры и агрегаты рекомбинантного белка, солюбилизируют в сильном денатуранте или детергенте, таком как гидрохлорид гуанидина, натрийдодецилсульфат (НДС), Тритон и т.п.

Полученный белковый раствор отделяют от любых нерастворимых веществ и после удаления сильного денатуранта или детергента получают белковый раствор, содержащий рекомбинантный белок, переведенный в свою нативную биоактивную конфигурацию, высокомолекулярные белковые примеси, низкомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси. Подобные растворы обычно содержат 1-50 мг/мл полного белка и 0,05-4 мг/мл рекомбинантного белка.

Отношение полимера к мономеру (П/Мв)в таком растворе включает отношение по массе агрегатов, включая пустого пика к мономеру, в силу чего является мерой чистоты раствора. Раствор обычно проходит стадию "предочистки", на которой отношение П/М снижают до примерно 0,5 или ниже. Затем раствор может быть подвергнут дальнейшей очистке и переработан в конечный продукт, как правило, использованием ЕАЕ-Сефарозы или другой приемлемой колонки. Настоящим изобретением дается способ удаления высокомолекулярных примесных белков с одновременным достижением более высокой степени выделения мономера и более низкого отношения П/М.

Соли металла IIА Группы добавляют к такому раствору, в соответствии с настоящим изобретением, с целью осаждения высокомолекулярных примесных белков. Высокомолекулярные примесные белки, осаждающиеся при добавлении солей металла IIА Группы, удаляют из раствора обычными средствами, такими как фильтрование, центрифугирование и т.п. Полученный белковый раствор, содержащий рекомбинантный белок, низкомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси при наличии таковых, подвергают дальнейшей обработке по мере необходимости с удалением низкомолекулярных примесных белков и других небелковых примесей, таких как осадители, солюбилизирующие средства, окислители, восстановители т.п. Обычно такие небелковые примеси удаляют диализом, хроматографией или иными приемлемыми способами, в то время как низкомолекулярные примесные белки отделяют от белка ионообменной хроматографией или ее разновидностью.

Белковый раствор подвергают дальнейшей обработке с получением белка или белковой композиции, пригодных для намеченного использования, обычно лиофилизацией. Такие методы хорошо известны.

Соли металлов IIА Группы, применимые в настоящем изобретении, включают все соли элементов IIА Группы Периодической таблицы: беррилия, магния, кальция, стронция, бария и радия. Рекомендуемые соединения включают соли магния, кальция, бария и стронция.

Наиболее рекомендуемые соединения настоящего изобретения включают: сульфат (SO4), хлорид (Cl2) и нитрат (NO3) магния, кальция, бария и стронция. Рекомендуемые соединения включают: сульфат кальция (CaSO4), безводный CaSO4, полугидрат CaSO4, нитрат кальция (Ca(NO3)2), лактат кальция, сульфат магния (MgSO4), хлорид магния (MgCl2), хлорид бария (BaCl2) и хлорид стронция (SrCl2).

Хотя количество солей металла IIА Группы, необходимое для осаждения, меняется в зависимости от концентрации белка, характеристик белка, добавляемого соединения и т.п. тем не менее соли металла IIА Группы обычно добавляют к раствору в количествах, достаточных для создания концентрации соединения в растворе 0,1-10% об, предпочтительно 1-3%
Рекомбинантным белком, выделяемым способом настоящего изобретения, может быть любой белок с молекулярной массой более 5000, продуцируемый рекомбинантными микроорганизмами, как правило, в телах включения. В их числе соматотропин, инсулины, соматомедины, соматостатины, пролактины, плацентальные лактогены и т.п.

Наиболее предпочтительно, если способом настоящего изобретения выделяют рекомбинантные соматотропины (молекулярная масса около 20000. Рекомбинантным соматотропином может быть рекомбинантный соматотропин из любого источника, но предпочтительно это бычий, свиной, птичий, овечий, человеческий рекомбинантный соматотропин, наиболее предпочтительно свиной или бычий рекомбинантный соматотропин.

Способы получения таких рекомбинантных белков хорошо известны, см. например, патент США NN 4604359 и 433717, раскрывающие способы получения человеческих рекомбинантных соматотропинов, патент США NN 4431739, раскрывающий способ получения рекомбинантных соматотропинов, заявка на Европейский патент 0104920, раскрывающая способ получения рекомбинантного свиного соматотропина, патент США N 4443359, раскрывающий способ получения рекомбинантного бычьего соматропина, работу Schoner, Biotechnology, 3(2), 151-54, раскрывающую способ получения рекомбинантного соматотропина, и работу Buell, Nucleic Acid Res. 13, 1923-38 (1985), раскрывающую способ получения рекомбинантного соматомедина С.

Кроме того, в заявке на Европейский патент, публикация 0103395, описано конструирование штамма-трансформанта E. coti, содержащего первую плазмиду, кодирующую бычий дельта-9-(Ser)-соматотропин (соматотропин, уменьшенный на свои 9 N-концевых аминокислот и с дополнительным остатком серина в N-окончании) под контролем лямбда-PL-промотора-оператора и имеющий область Шайн-Дальгарно, происходящего из бактериофага mu. Трансформатор содержит также вторую плазмиду (рс 1857), кодирующую продуцирование чувствительного к температуре белка-репрессора рс 1857. Белок-репрессор может быть дезактивирован повышением температуры примерно до 42oС с индуцированием в результате экспрессии бычьего дельта-9-(Ser)-соматотропина. Штамм-трансформант этого типа /E. coti HBIOI (PL-mu-дельта-9-(Ser)-соматотропин коровы и рс 1857) депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Роквилл, шт. МД под регистрационным N 53030.

Конструирование аналогичного штамма-трансформанта, кодирующего продуцирование свиного дельта-7-соматотропина (свиной соматотропин, уменьшенный на свои 7 N-концевые аминокислоты) описано в заявке на Европейский патент, публикация N 0104920. Штамм-трансформант этого типа/E.coti HBIOI (PL-mu-дельта-7-соматотропин свиньи и рс 1857) депонирован в АТСС под регистрационным N 53031.

Штаммы 53030 и 53031 являются продуктивными производителями соответственно бычьего дельта-9-(Ser)-соматотропина и свиного дельта-7-соматоропина. В обоих случаях экспрессированный белок секвестирован в клетке в виде нерастворимых, биологически неактивных, видимых под микроскопом тел включения. Известны и другие способы получения многих других аналогичных белков.

В рекомендуемом воплощении изобретения раствор рекомбинантного соматотропина, содержащий 1-50 мг/мл общего белка и 0,05-2 мг/мл рекомбинантного соматотропина, обрабатывают 1-3% CaSO4 с осаждением высокомолекулярных белковых примесей. Осадок удаляют центрифугированием, а рекомбинантный соматотропин выделяют из полученного раствора с помощью вышеприведенных процедур.

Хотя вышеописанный способ выделения направлен на выделение рекомбинантных белков, способ в равной степени применим для отделения и выделения нерекомбинантных белков. К примеру, раствор, содержащий смесь (1) "полезного или целевого белка" (2) высокомолекулярных белков (с молекулярной массой, примерно в 1,5 раз превышающей молекулярную массу полезного белка) и (3) низкомолекулярных белков (с молекулярной массой, примерно в 1,5 раз меньше, чем у полезного белка), обрабатывают способом настоящего изобретения и осаждением высокомолекулярных белков и в результате отделением высокомолекулярных белков от полезного белка и низкомолекулярных белков. Высокомолекулярные белки отделяют от раствора и отбрасывают или при желании подвергают дальнейшей обработке, так высокомолекулярные белки могут быть выделены из осадка его повторным растворением и извлечением белков из раствора.

Полезный белок отделяют от низкомолекулярных белков обычными способами и при желании подвергают дальнейшей обработке с получением белкового продукта. Низкомолекулярные белки, отделенные от полезного белка, отбрасывают или при желании подвергают дальнейшей обработке. Как правило, низкомолекулярные белки могут быть отделены от полезного белка хроматографией или иным способом, применимым для разделения белков с близкими молекулярными массами. Многие такие способы разделения белков хорошо известны опытному специалисту и в равной степени применимы в настоящем изобретении.

После того как изобретение раскрыто в общих чертах, нижеследующие примеры даются в качестве конкретных воплощений изобретения и с целью показать его практические возможности и его преимущества. Ясно, что примеры даются только с целью иллюстрации и ни в коей мере не предназначены для ограничения описания или последующей формулы изобретения. В частности, применяемые в опытах тела включения получены из трансформированных штаммов E.coti, продуцирующих свиной дельта-7-соматотропин. Тела включения выделены из E.coti штамма-хозяина HBIOI, трансформированного первой плазмидой (PL-mu-дельта-7-сСТ), кодирующей дельта-7 сСТ, и второй плазмидой (рс 1857), кодирующей чувствительный к температуре белок-репрессор лямбда-фага. Многие другие микроорганизмы продуцируют тела включения, содержащие рекомбинантные белки многих типов, которые будут работать в настоящем изобретении. Аналогично, способы выращивания таких микроорганизмов с целью получения тел включения хорошо известны.

Пример 1. Рекомбинантный свиной соматотропин (рсСТ) выделяют из тел включения (1) растворителем тел включения в натрийдодецилсульфате (НДС) в карбонатном буфере (25 мМ NaHCO3 и 21 мМ Na2CO3), (2) удалением из раствора нерастворимых примесей, (3) добавлением окислителя для окисления рсСТ и (4) удалением из раствора НДС с тем, чтобы позволить рсСТ принять биоактивную конфигурацию. Полученный белковый раствор содержит рсСТ, высокомолекулярные примесные белки и другие небелковые примеси.

К полученному раствору белка с восстановленной конфигурацией, содержащему 0,67 мг/мл мономерного рсСТ, с П/М отношением 5,1 (рН 9,8 при 22-25oC) добавляют CaSO4•2H2O до концентрации 2,5% (мас./об.) и перемешивают 2 часа. Смесь центрифугируют 10 минут при 5000•G с получением надосадочной жидкости. Содержание мономерного рсСТ и П/М отношение в надосадочной жидкости анализируют с помощью жидкостной хроматографии для быстрого определения белков (ЖХБОБ) на Супероузе-12. Полученные результаты показывают, что отношение П/М снизилось до 0,3, а выделение мономера составляет 83% Полученные данные показывают, что белковые агрегатные примеси и высокомолекулярные примесные белки селективно осаждаются CaSO4•2H2O с оставлением в растворе мономеров.

Пример 2. Воспроизведен пример 1, но с применением других солей кальция: безводного CaSO4, полугидрата CaSO4, нитрата кальция (Ca(NO3)2 и лактата кальция. Полученные результаты приведены в табл.1.

Данные табл. 1 показывают, что агрегатные примеси и высокомолекулярные примесные белки селективно осаждаются при добавлении перечисленных солей.

Пример 3. Воспроизведен пример 1, но с применением солей щелочноземельных металлов: магния, бария и стронция. Полученные результаты приведены в табл.2.

Данные табл. 2 показывают, что агрегатные примеси и высокомолекулярные примесные белки селективно осаждаются указанными в таблице солями щелочноземельных металлов.

Пример 4. К раствору белка с восстановленной конфигурацией примера 1, содержащего 0,4 мг/мл рсСТ мономера, с П/М отношением 4,7, добавляют CaCl2•2H2O до концентрации 0,4% (мас./об) и перемешивают 30 минут при комнатной температуре (22-25oC).

Значение рН смеси устанавливают равным примерно 9 и после центрифугирования 10 минут при 5000хG собирают надосадочную жидкость, которую анализируют ЖХБОБ на Супероузе-12.

В результате П/М отношение снижено до 0,4, а выделение мономера составляет 92,1% Эти данные свидетельствуют, что CaCl2•2H2O осаждает белковые агрегаты и высокомолекулярные примесные белки селективно с оставлением в растворе мономера.

Пример 5. Раствор белка с восстановленной конфигурацией примера 1 концентрируют примерно вдвое и диафильтруют относительно 80 мМ этаноламинного буфера при рН 9. К диафильтрованному белковому раствору, содержащему 0,67 мг/мл мономерного рсСТ, с П/М отношением 3,5 добавляют CaCl2•2H2O до концентрации 0,4% (мас./об) и перемешивают 30 минут при 22-25oC. Центрифугированием 10 минут при 5000хG отделяют надосадочную жидкость, которую анализируют с помощью ЖХБОБ на Супероузе-12.

В результате отношение П/М снижено до 0,22, а выделение мономера составляет 91,5% Приведенные данные показывают, что CaCl2•2H2O селективно осаждает белковые агрегаты и высокомолекулярные примесные белки в этаноламиновой буферной системе.

Очевидно, что в свете вышеизложенного возможны многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения. В связи с этим необходимо подчеркнуть, что в объеме прилагаемой формулы изобретения само изобретение может быть осуществлено как-то иначе, чем в приведенных примерах.

Похожие патенты RU2099348C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПИНА 1990
  • Викрам П.Мехротра[Us]
  • Рэй Е.Баркер[Us]
RU2075509C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ СОМАТОТРОПИНОВ, СТАБИЛЬНЫЕ СОМАТОТРОПИНЫ И КОМПОЗИЦИЯ СТАБИЛЬНОГО СОМАТОТРОПИНА 1991
  • Зафар И.Рандава[Us]
  • Джеймс Е.Сили[Us]
RU2073686C1
Способ выращивания свиней 1991
  • Брайан Р.Скрикер
SU1837790A3
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА-2 ИЗ НЕРАСТВОРИМЫХ ТЕЛ ВКЛЮЧЕНИЯ 1996
  • Бажутина Н.В.
  • Гурьев В.П.
  • Гурьева Т.Л.
  • Закабунин А.И.
  • Колокольцов А.А.
  • Ковригина М.А.
  • Моисеенкова О.А.
  • Романов В.П.
  • Юдина И.В.
RU2123010C1
УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДДУКТОВ АМИНОВ С О-ГИДРОКСИАЛЬДЕГИДАМИ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ОСНОВАНИЯМИ ШИФФА, И АДДУКТНЫЙ КОНЕЧНЫЙ ПРОДУКТ КОНДЕНСАЦИИ 1999
  • Хей Брюс Аллан
  • Кларк Майкл Томас
RU2201936C2
Рекомбинантный соматостатинсодержащий белок, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мясной и молочной продуктивности сельскохозяйственных животных, а также способ использования препарата 2016
  • Юдин Сергей Михайлович
  • Лунин Владимир Глебович
RU2614115C1
ИМПЛАНТАТ ДЛЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ С КОНТРОЛИРУЕМОЙ ДОСТАВКОЙ 1992
  • Уильям Дэвид Стибер[Us]
  • Сюзан Мансини Кади[Us]
  • Дэвид Фарли Джонсон[Us]
  • Тереза Райс[Us]
RU2080119C1
ОЧИСТКА БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ КАТИОННОГО ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА 2006
  • Фишер Меир
  • Харош Элияху
RU2426738C2
α -АМИДИРУЮЩАЯ МОНООКСИГЕНАЗА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ a -АМИДИРОВАННОЙ ФОРМЫ РЕГУЛЯТОРНОГО ПОЛИПЕПТИДА 1988
  • Джеймс П.Джиллиген[Us]
  • Бэрри Н.Джоунз[Us]
  • Артур Х.Бертельзен[Us]
  • Нозер М.Мехта[In]
RU2080385C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА-ГАММА ЧЕЛОВЕКА 1997
  • Закабунин А.И.
  • Барановская Г.А.
  • Пустошилова Н.М.
  • Майстренко В.Ф.
  • Гаврюченкова Л.П.
  • Громова О.А.
RU2132386C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 099 348 C1

Реферат патента 1997 года СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ СОМАТОТРОПИНА

Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК соматотропин извлекают из трансформированных клеток, растворяют и реактивируют при помощи известных методов, к раствору реактивированного белка при рН 9,0 - 9,8 добавляют соль либо кальция, либо магния, либо бария, либо стронция в количестве, необходимом для получения конечной концентрации от 0,4 до 2,5%, инкубируют реакционную смесь при перемешивании до полного осаждения высокомолекулярных белковых примесей, осадок отбрасывают, а полученный раствор подвергают дальнейшей очистке. 4 з.п.ф-лы, 2 табл.

Формула изобретения RU 2 099 348 C1

1. Способ выделения рекомбинантного полипептида с последовательностью соматотропина из раствора, содержащего примеси высокомолекулярных белков, предусматривающий извлечение гетерогенного белка из трансформированных клеток, его растворение и реактивацию, отделение высокомолекулярных примесей и окончательную очистку целевого продукта, отличающийся тем, что после получения раствора реактивированного соматотропина к нему при pH 9,0 9,8 добавляют соль, либо кальция, либо магния, либо бария, либо стронция в количестве, необходимом для получения конечной концентрации 0,4 2,5% инкубируют смесь при перемешивании до полного осаждения белков с молекулярной массой, по крайней мере в два раза превышающей молекулярную массу соматотропина, полученный осадок отделяют, а раствор подвергают дальнейшей очистке. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию общего белка в растворе составляет 1 50 мг/мл, а концентрация выделяемого полипептида - 0,05 2,0 мг/мл. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль выбирают из группы, включающей сульфат, хлорид и нитрат. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что соль выбирают из группы, включающей безводный сульфат кальция, дигидрат сульфата кальция, полугидрат сульфата кальция, нитрат кальция, хлорид кальция, дигидрат хлорида кальция, сульфат магния, хлориды магния, бария и стронция. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве соли используют лактат кальция.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1997 года RU2099348C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
EP, 0226639, кл
Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы 1923
  • Бердников М.И.
SU12A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
US, 4511502, кл
Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов 1921
  • Ланговой С.П.
  • Рейзнек А.Р.
SU7A1

RU 2 099 348 C1

Авторы

Галина Блум[Pl]

Рен-Дер Янг[Us]

Фун К.Ли[Kr]

Даты

1997-12-20Публикация

1992-07-21Подача