СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА СРЕДСТВА ДЛЯ ОБРАБОТКИ РАСТЕНИЙ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/04 A01C1/08 

Изобретение относится к технологии производства средств для иммунизации и регулирования роста растений.

Известен способ производства средства для обработки растений, предусматривающий культивирование микромицета Mortierella hygrophila ВКМ F-1854, отделение биомассы, выделение из нее полупродукта, содержащего в качестве активного начала этиловый или метиловый эфиры арахидоновой кислоты и введение в него дополнительных компонентов для получения целевого продукта (RU, патент N 2058078, кл. А 01 N 63/04, 1996).

Недостатком этого способа является использование узкой сырьевой базы, содержащей малое количество активного начала и узкий спектр действия получаемого средства, ограниченный только иммунизацией.

Целью изобретения является расширение сырьевой базы и повышение выхода активного начала из сырья, а также расширение спектра действия получаемого средства.

Это достигается тем, что в способе производства средства для обработки растений, предусматривающем культивирование микромицета рода Mortierella, отделение биомассы, выделение из нее полупродукта, содержащего в качестве активного начала производные арахидоновой кислоты, и введение в него дополнительных компонентов для получения целевого продукта, из микромицентов рода Mortierella используют вид Mortierella alpina.

Это позволяет увеличить выход активного начала, расширить сырьевую базу и получить средство, обладающее более широким спектром действия за счет возможности получения активного начала в виде кислоты и появления в выделенном полупродукте эйкозапентаеновой кислоты или ее низших алкиловых эфиров.

В предпочтительном варианте изобретения предусмотрено выделение полупродукта из биомассы путем экстрагирования, желательно с использованием в качестве экстрагента метилового и/или этилового спирта и/или предельных или непредельных углеводородов, содержащих 5-10 атомов углерода в молекуле, и/или их галогенпроизводных, и/или сжиженных газов, выбранных из группы, включающей инертные газы, азот, закись азота, двуокись углерода, предельные и непредельные углеводороды, содержащие до 4 атомов углерода в молекуле, их галогенпроизводные и их смеси.

Это позволяет получить препарат с минимальным содержанием сопутствующих веществ за счет селективности экстрагентов.

В этом случае возможно интенсифицировать процесс получения полупродукта за счет осуществления экстрагирования в поле СВЧ, или в электростатическом поле высокой напряженности, или в постоянном или переменном магнитном поле, или в поле ультразвуковых колебаний. В последнем случае желательно создавать ультразвуковые колебания путем конденсации в экстракционной смеси паров экстрагента. Это позволяет одновременно интенсифицировать процесс выделения полупродукта и снизить его энергоемкость.

В этом же случае возможно проведение перед экстрагированием гидролиза, или ферментолиза, или плазмолиза, или радиолиза биомассы.

Это позволяет повысить выход полупродукта.

В этом же случае также возможно проведение концентрирования экстракта, предпочтительно упариванием или мембранных методом.

Это позволяет сократить расход экстрагента.

Также в этом же случае возможно осуществление сушки биомассы перед экстрагированием, предпочтительно путем лиофилизации.

Это облегчает экстракционное выделение полупродукта, а в последнем случае сокращает технологические потери активного начала. В этом же случае возможно осуществление обработки биомассы перед экстрагированием низшим спиртом или смесью низших спиртов, наиболее желательно в присутствии минеральной кислоты или ацетилхлорида. Это позволяет сократить выход сопутствующих веществ в процессе экстрагирования.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения предусмотрено дополнительное введение в полупродукт воды и/или низших спиртов с получением целевого продукта в жидкой товарной форме, при этом целесообразно фасовать смесь в герметичную тару, наиболее целесообразно в газовой среде, содержащей инертные газы, и/или азот, и/или закись азота, и/или двуокись углерода. Это позволяет получить средство в жидкой товарной форме с увеличенным сроком хранения.

В другом предпочтительном варианте в полупродукт дополнительно вводят твердый наполнитель, антислеживатель и смачиватель с получением твердой товарной формы. Это позволяет расширить ассортимент готовой продукции и облегчить возможность ее хранения.

В этом случае возможно осуществлять таблетирование или гранулирование смеси, а также фасовку в герметичную тару или герметичную упаковку, наиболее предпочтительно в газовой среде состава, аналогичного указанному выше. Это позволяет получить средство длительного срока хранения.

Еще одним предпочтительным вариантом предусмотрено введение в полупродукт антиоксиданта. Это позволяет дополнительно повысить срок хранения полупродукта.

Способ реализуется следующим образом.

Микромицет вида Mortierella alpina культивируют на питательных средах до максимального накопления биомассы, последнюю отделяют от культуральной жидкости.

В зависимости от состава используемого субстрата и условий культивирования в биомассе накапливается от 8 до 27% в пересчете на сухое вещество арахидоновой кислоты и до 2,5% эйкозапентаеновой кислоты. В контрольных опытах на микромицете Mortierella hygrophila ВКМ F-1854 биомасса содержала не более 3% арахидоновой кислоты, а эйкозапентаеновая кислота ни в одном из случаев не была обнаружена.

Далее из отделенной биомассы непосредственно или после подготовки извлекают полупродукт, содержащий в качестве активного начала арахидоновую кислоту или ее низшие алкиловые эфиры, а также в ряде случаев эйкозапентаеновую кислоту или ее низшие алкиловые эфиры.

В качестве подготовки к извлечению полупродукта может быть осуществлена сушка биомассы, желательно лиофильная для максимального сохранения действующего начала. Для разрушения клеточных мембран грибов и облегчения выхода содержимого может быть использован гидролиз, ферментолиз, плазмолиз или радиолиз. Для облегчения очистки полупродукта от сопутствующих веществ биомассу можно обработать низшими спиртами, одним или несколькими, при этом для ускорения процесса образования эфиров жирных кислот этерификацию проводят в присутствии минеральной кислоты, например серной или соляной, или ацетилхлорида. Их добавление нецелесообразно в случае предварительного проведения кислотного гидролиза.

Выделение полупродукта из биомассы возможно осуществлять прессованием, но наиболее целесообразно осуществлять методом экстрагирования. Этот метод позволяет извлекать любые вещества наиболее полно. В то же время для снижения выхода из биомассы сопутствующих веществ экстрагент следует выбирать из группы, обладающей наибольшей селективностью. В эту группу входят метиловый и этиловый спирты, предельные и непредельные углеводороды, содержащие 5-10 атомов углерода в молекуле, и их галогенпроизводные, а также сжиженные газы, включающие инертные, азот, закись азота, двуокись углерода, предельные и непредельные углеводороды, содержащие до 4 атомов углерода в молекуле, и их галогенпроизводные, и смеси перечисленных экстрагентов.

Процесс экстрагирования может быть интенсифицирован рядом методов, не изменяющих селективность экстрагентов. К ним относятся проведение экстрагирования в поле СВЧ, в электростатическом поле высокой напряженности, в постоянном или переменном магнитном поле и в поле ультразвуковых колебаний. Они также не оказывают влияния на химический состав извлекаемых жирных кислот или их эфиров, которые не претерпевают превращений под действием перечисленных факторов.

В случае экстракционного извлечения полупродукта его концентрация в экстрагенте может составлять от нескольких сотых до нескольких десятых долей процента. Использование полупродукта в таком виде в целях длительного хранения или производства твердых товарных форм нецелесообразно. В этом случае проводят концентрирование экстракта путем упаривания в случае использования низкокипящего экстрагента или путем мембранного разделения в случае, если температура кипения экстрагента превышает безопасный предел тепловой обработки ненасыщенных жирных кислот.

В случае, когда осуществляется концентрирование экстракта упариванием, наиболее целесообразным представляется использование образующихся паров для интенсификации процесса экстрагирования путем создания ультразвуковых колебаний в экстракционной смеси при конденсации в ней барботируемых паров экстрагента. В этом случае достигается снижение энергопотребления за счет утилизации энергии фазового перехода экстрагента.

Выделенный таким образом полупродукт в дальнейшем используется для приготовления целевого продукта в твердой или жидкой товарной форме. Полупродукт содержит смесь жирных кислот или их низших алкиловых эфиров, в которую входят арахидоновая кислота или ее эфиры и, в ряде случаев, эйкозапентаеновая кислота или ее эфиры, являющиеся активным началом получаемых средств.

В отличии от полупродукта, получаемого по способу-прототипу, который содержит только эфиры арахидоновой кислоты в количестве 10-45% от суммы жирных кислот, полупродукт, получаемый по предлагаемому способу, содержит арахидоновую кислоту в количестве 30-50% от суммы жирных кислот и до 10% эйкозапентаеновой кислоты от суммы жирных кислот.

Для получения жидкой товарной формы в полупродукт вводят воду и/или низшие спирты. В таком виде готовый продукт может быть использован непосредственно после приготовления или расфасован для длительного хранения в герметичную тару, например пузырьки или ампулы. Для получения твердой товарной формы в полупродукт вводят твердый наполнитель, антислеживатель и смачиватель. Твердая товарная форма, как правило, не используется непосредственно после приготовления, а предназначается для длительного хранения, поэтому ее фасуют или упаковывают герметично. Для облегчения дозирования средства в твердой товарной форме осуществляют гранулирование или таблетирование порошка перед фасовкой или упаковкой.

Как твердая, так и жидкая товарная форма целевого продукта могут содержать микроэлементы и/или антиоксидант. Их вводят в состав композиции на стадии приготовления товарной формы. Микроэлементы способствуют расширению спектра действия и усилению эффективности применения средства, а антиоксидант способствует увеличению срока хранения средства за счет предотвращения окисления ненасыщенных жирных кислот, являющихся активным началом получаемого средства.

Поскольку химические изменения ненасыщенных жирных кислот, в первую очередь, связаны с окислением кислородом воздуха, то рекомендуется весь технологический процесс, а особенно фасовку или упаковку, осуществлять в среде газа, не способного к химической реакции с веществами активного начала средства. К ним относятся инертные газы, азот, закись азота, двуокись углерода и их смеси. Продукт, полученный в среде этих газов, хранится практически без изменения химического состава в течение трех лет.

Применение полученного таким образом средства при обработке растений показало, что оно обладает иммуностимулирующей активностью против различных патогенных грибов, бактерий, вирусов и нематод, а также стимулирует рост растений, что не было характерно для средства, полученного по способу-прототипу.

Пример 1. Было исследовано 5 вариантов почв из окрестностей г.Пущино Московской области. Почвенную суспензию в разведении 1:100-1:10000 высевали на чашки Петри с 5 вариантами сред: агар с разведенным суслом (1:9); голодный агар; картофельный агар с 0,5% глюкозы; среда Чапека с 0,5% глюкозы; почвенная агаризованная среда. Начальная рН сред составляла 5,0-5,5, температура культивирования 25^oС.

В течение 14 сут ежедневно наблюдали за ростом и проводили примерную идентификацию выросших грибов. Отбирались грибы, принадлежащие по морфологическим признакам к порядку Mucorales семейства Mortierellaceae, для которых характерны пушистый бесцветный мицелий без перегородок, распространяющийся концентрическими зонами или лопастями при полном отсутствии или слабом спорангиальном спороношении характерной структуры. В результате проведенной работы было отобрано 5 изолятов, с которыми была проведена селекция продуцентов арахидоновой кислоты микробиологическим методом. Отобранные изоляты пересевали на глюкозокартофельный агар с ацетилсалициловой кислотой. Среда содержала, г/л: отвар картофеля 100, глюкоза 10, агар 20, ацетилсалициловая кислота 0,84. Ацетилсалициловую кислоту растворяли в этаноле и вносили в стерильную среду. Культивирование проводили при 25^oС в течение 14 сут. В процессе исследований из 5 отобранных изолятов один не рос на данной среде с ацетилсалициловой кислотой. Дальнейшую работу проводили с данным изолятом с присвоенным номером БС-1. Была проведена идентификация данного штамма, изучен его жирнокислотный состав. На сусло-агаре при 28^oС культура семидневной колонии белая, пушистая. Высота воздушного мицелия 1,0-1,5 см. Скорость роста мицелия на чашках Петри при 28^oС составляет 5-6 мм в сутки.Температурный оптиум для роста мицелия 28^oС. От места инокуляции агаровой среды мицелий распространяется концентрическими зонами или лопастями в виде неправильной розетки. Гифы бесцветные, их ширина 5-7 мкм, длина 10-60 мкм. Слабо спороносят на сусло-агаре, хорошо на голодном агаре. Спорангиеносцы шиловидные, 60-150 мкм, диаметр у верхушки 2-4 мкм, у оснований 6-16 мкм, отходят от субстрата. Спорангии округлые с бугристыми выступами, у основания часто слегка приплюснутые, диаметр 10-20 мкм, четырехспоровые. Спорагиоспоры эллиптически-цилиндрические, 4-5,5х1,5-2,5 мкм, обычно с 1-2 каплями жира. Данные морфологические признаки соответствуют Mortierella alpina Peyronel, входящему в семейство Mortierellacea порядок Mucorales класс Phycomycetes отдел Mycophyta (Милко А.А. Определитель мукоральных грибов. Киев: Наукова думка, 1974).

Средство готовят путем культивирования выделенного, как описано выше, из почвы штамма микромицета Mortierella alpina до максимального накопления мицелиальной массы, ее лиофильной сушкой, метанолизом в присутствии соляной кислоты, экстрагированием этанолом, добавлением бутилокситолуола разбавлением экстракта водой. Полученное средство используют для обработки семян пшеницы сорта Скифянка из расчета 0,5 мг на 1 т семян. Всхожесть по сравнению с контролем повышена на 18% энергия прорастания на 20% При дополнительной обработке вегетирующих растений развитие корневых гнилей фузариозно-церкоспореллезного типа снизилась на 35-53% урожайность повысилась на 5-6 ц/га. При опрыскивании посевов развитие мучнистой росы снизилось на 68-75% септориозной пятнистости на 36-41% фитофторозной на 37-47% заспоренность семян возбудителями альтернариоза при обработке посевов в период колошения снизилась в 6 раз.

Пример 2. Средство готовят путем культивирования штамма Mortierella alpina, выделенного из почвы по примеру 1, до максимального накопления мицелиальной массы, отделения биомассы, сушки под вакуумом при 55^oС, экстрагирования в непрерывном потоке жидкой двуокиси углерода в поле ультразвуковых колебаний, создаваемых при конденсации в экстракционной смеси паров экстрагента, при температуре 20^oС и давлении 6,7 МПа, выделения полупродукта из экстракта при повышении температуры до 40^oС, его смешивания с мочевиной, раствором бутилокситолуола в гексане, компонентами "Твин-20" и "Аэросил АМ-1-300" и микроэлементами калием, марганцем и медью. Полученное средство таблетируют и упаковывают в блистеры в атмосфере, содержащей аргон с примесями других инертных газов. После хранения в течение 3 лет средство растворяют в воде и проводят обработку огурцов сорта Королек на стадии предпосадочной из расчета 1 мг активного начала на 1 т семян и на вегетирующих растениях из расчета 10 мг активного начала на 1 га посадки. Облиственность по сравнению с контролем увеличилась на 21,4% мучнистая роса устранена полностью, вирус-стрик полностью, заболевания черной бактериальной пятнистостью снижены вдвое, зараженность галловыми нематодами снижена в 3 раза, количество плодов увеличилось на 50%
Таким образом, предлагаемый способ позволяет при расширении сырьевой базы получить средства для обработки растений в жидкой и твердой товарных формах, обладающие как иммуностимулирующей активностью, так и являющиеся регуляторами роста.

Применение: сельское хозяйство и биотехнология, в частности, при производстве средства, обладающего иммуностимулирующей активностью, являющегося одновременно регулятором роста растений. Сущность изобретения: способ предусматривает приготовление средства обработки растений путем культивирования микромицета Mortierella alpina, отделения биомассы, выделения из нее полупродукта, содержащего в качестве активного начала производные арахидоновой кислоты, и введения в него дополнительных компонентов для получения целевого продукта. 24 з.п.ф-лы.

1. Способ производства средства для обработки растений, предусматривающий культивирование микромицета рода Mortierella, отделение биомассы, выделение из нее полупродукта, содержащего в качестве активного начала производные арахидоновой кислоты, и введение в него дополнительных компонентов для получения целевого продукта, отличающийся тем, что из микромицетов рода Mortierella используют вид Mortierella alpina. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение полупродукта из биомассы осуществляют путем экстрагирования. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве экстрагента используют метиловый, и/или этиловый спирты, и/или предельные или непредельные углеводороды, содержащие 5 10 атомов углерода в молекуле, и/или их галогенпроизводные, и/или сжиженные газы, выбранные из группы, включающей инертные газы, азот, закись азота, двуокись углерода, предельные и непредельные углеводороды, содержащие до 4 атомов углерода в молекуле, их галогенпроизводные и их смеси. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют в поле СВЧ. 5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют в электростатическом поле высокой напряженности. 6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют в постоянном или переменном магнитном поле. 7. Способ по любому из пп. 2 6, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют в поле ультразвуковых колебаний. 8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что ультразвуковые колебания создают путем конденсации в экстракционной смеси паров экстрагента. 9. Способ по п. 2, отличающийся тем, что перед экстрагированием проводят гидролиз, или ферментолиз, или плазмолиз, или радиолиз биомассы. 10. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экстракт концентрируют. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что концентрирование осуществляют упариванием. 12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что концентрирование осуществляют мембранным методом. 13. Способ по п. 2, отличающийся тем, что биомассы перед экстрагированием сушат. 14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что сушку осуществляют путем лиофилизации. 15. Способ по п. 2, отличающийся тем, что биомассу перед экстрагированием обрабатывают низшим спиртом или смесью низших спиртов. 16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что обработку спиртом или смесью спиртов осуществляют в присутствии минеральной кислоты или ацетилхлорида. 17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве дополнительных компонентов в полупродукт вводят воду и/или низшие спирты. 18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что после введения дополнительных компонентов смесь фасуют в герметичную тару. 19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что фасовку осуществляют в газовой среде, содержащей инертные газы, и/или азот, и/или закись азота, и/или двуокись углерода. 20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве дополнительных компонентов в полупродукт вводят твердый наполнитель, антислеживатель и смачиватель. 21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что полученную смесь таблетируют. 22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что полученную смесь гранулируют. 23. Способ по п. 21 или 22, отличающийся тем, что гранулы или таблетки фасуют в герметичную тару или упаковку. 24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что фасовку осуществляют в газовой среде, содержащей инертные газы, и/или азот, и/или закись азота, и/или двуокись углерода. 25. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в полупродукт дополнительно вводят антиоксидант.