ШТАММ ГРИБА MORTIERELLA ALPINA PEYRONEL БС-2 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ВЫСШИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/14 C12P7/64 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к сельскохозяйственной, медицинской и пищевой микробиологии, в частности к штамму-продуценту полиненасыщенных высших жирных кислот, которые используются для производства различных препаратов, применяемых в сельском хозяйстве, в ветеринарии, в медицине, в косметологии и в пищевой промышленности.

Известны штаммы грибов рода Mortierella: Mortierella alpina, Mortierella bainiari, Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella minutissima, Mortierella verticilata, Mortierella hygrophila и Mortierella polycephala для получения арахидоновой кислоты (ЕР, 0223960 A2, кл. C 12 P 7/64, 1986; WO 92/13086, кл. C 12 P 7/64, A 23 C 9/00, A 61 K 6/00, 7/00, 1992; RU, патент N 2120998, кл. C 12 P 7/40, 1991).

Известен также штамм Mortierella hygrophila BKM F-1854, продуцирующий 10-45 (отн. %)) арахидоновой кислоты от суммы жирных кислот (RU, патент N 2058078, кл. A 01 N 63/04, 1996).

Недостатком данных способов с использованием определенных штаммов является то, что, несмотря на относительно большое количество получаемой арахидоновой кислоты, неясно, могут-ли эти штаммы производить другие полиненасыщенные высшие жирные кислоты (ПНВЖК) в зависимости от условий культивирования, поскольку в некоторых случаях требуется изменять соотношение между ПНВЖК, с сохранением максимального количества арахидоновой кислоты, то есть неясно, могут-ли эти штаммы быть универсальными в условиях производства.

Известен штамм гриба Mortierella alpina Peyronel БС-1 (VKM F-3605D), являющийся продуцентом полиненасыщенных высших жирных кислот. Штамм вырабатывает до 30-50% арахидоновой кислоты от суммы всех высших жирных кислот (RU, патент N 2075934, кл. A 01 N 63/04, A 01 C 1/8, 1996). Описание и получение штамма приведено в указанном патенте (родительский штамм, прототип).

Известный штамм не позволяет получать арахидоновую и другие ПНВЖК в еще больших количествах.

Целью изобретения является получение штамма, вырабатывающего еще более значительные количества арахидоновой кислоты, а также позволяющего изменять состав ПНВЖК в сторону более ненасыщенных и длинных кислот, в зависимости от условий культивирования.

Предложен новый штамм гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2 (VKM F-3625D) для производства полиненасыщенных высших жирных кислот и их производных.

Новый штамм получен путем отбора моноспорового изолята после воздействия ультрафиолетом на суспензию спор Mortierella alpina Peyronel БС-1 (VKM F-3605D), с последующим анализом содержания арахидоновой кислоты (маркерная характеристика) в изолятах методом ГЖХ. Авторский номер нового штамма БС-2. Хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов под международным депозитарным номером VKM F-3625D. В данное время штамм является производственным.

Штамм Mortierella alpina Peyronel БС-2 (ВКМ F-3625Д) имеет следующие культурально-морфологические особенности при его культивировании на жидких средах.

При культивировании штамма в колбах на жидких средах наблюдается, как правило, мицелиальный рост. Иногда гриб растет в виде рыхлых шариков диаметром от 2 до 6 мм. Мицелий имеет желтовато-кремовый цвет и обладает специфическим запахом, похожим на запах рыбьего жира. В начале культивирования гифы слабо ветвящиеся, шириной 5-9 мкм, длиной 50-100 мкм. В процессе культивирования наблюдается образование жировых клеток, заполненных каплями жира. Жировые клетки имеют неправильную форму обычно с несколькими (2-4) перегородками.

Штамм культивируют при температуре 24-28^oC в колбах (750 мл) со 100 мл среды на качалке при 220 об/мин в течение 5-7 суток.

Стандартные условия выращивания приведены ниже в качестве примеров.

Пример 1. Среда 1, следующего состава (г/л):
глюкоза - 80
пептон - 10
дрожжевой экстракт Difco - 5
KH₂PO₄ - 2
MgSO₄ • 7H₂O - 0,5
Пример 2. Среда 2 (г/л):
пшено - 40
(NH₄)₂SO₄ - 1,0
KH₂PO₄ - 1,0
MgSO₄ • 7H₂O - 0,5
KCl - 0,5
CaCl₂ - 0,15
Вода - 1000 мл
Пшено варить в большом объеме воды 1 час, внести соли, стерилизовать при 115^oC 30 мин.

Пример 3. Среда 3 (г/л):
глюкоза - 80,0
дрожжевой экстракт Difco - 1,0
(NH₄)₂SO₄ - 3,0
MgSO₄ • 7H₂O - 0,5
KCl - 0,5
KH₂PO₄ - 2,0
CaCl₂ - 0,15
FeSO₄ • 7H₂O - 40 мг/л
ZnSO₄ • 7H₂O - 30 мг/л
CuSO₄ • 5Н₂O - 10 мг/л
MnSO₄ • 5Н₂О - 5 мг/л
CoCl₂ - 0,5 мг/л
Штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки на плотных средах.

Пример 4. Культурально-морфологические признаки на сусло-агаре.

Состав среды - сусло неохмеленное 6-7^oБ, агар 2%, pH 7.

Стерилизация при 115^oC 30 минут.

Гриб культивируют на чашках Петри (диаметр 9 см) в темноте при 28^oC 7 суток.

Колонии на сусло-агаре 70-75 мм в диаметре, белые, пушистые, нарастают мелкими лопастями в виде неправильной розетки, с линейной скоростью роста 6-7 мм в сутки; с развитым воздушным вегетативным мицелием, хлопьевидно-пушистые, 0,5-0,8 см высотой; слабо спороносящие. Спорангиеносцы прямые, шиловидные, 60-150 мкм длиной; у верхушки 2-4 мкм в диаметре, у основания 6-10 мкм с клеткой ножкой; простые, отходят одиночно и чаще от субстрата. Спорангии округлые, с бугристыми выступами, у основания слегка приплюснутые, 10-20 мкм в диаметре, многоспоровые образуются на более длинных спорангиеносцах; и односпоровые эллиптически-шаровидные, иногда слегка угловатые, 10-14 мкм в диаметре, возникают на более коротких спорангиеносцах. Спорангиеспоры эллиптическо-цилиндрические 4-5,5 • 1,5-2,5 мкм, обычно с 1-2 каплями жира.

Пример 5. Культурально-морфологические признаки на глюкозо-картофельном агаре.

Состав среды - отвар картофеля - 100 мл, глюкоза - 10 г, агар - 20 г, вода водопроводная до 1000 мл. Стерилизуют при 115^oC 30 минут.

Гриб культивируют на чашках Петри (диаметром 9 см) в темноте при 28^oC 7 суток.

Семисуточные колонии на глюкозо-картофельном агаре 35-40 мм в диаметре, белые, пушистые, нарастают мелкими лопастями в виде неправильной розетки с линейной скоростью роста 6-7 мм в сутки; с развитым воздушным вегетативным мицелием, хлопьевидно-пушистые, 0,5-0,8 см высотой; слабо спороносящие. Строение и размеры спорангиеносцев, спорангий и спорангиеспор аналогичны приведенным в примере 4.

Пример 6. Культурально-морфологические признаки на голодном агаре.

Состав среды - агар - 20 г, вода водопроводная - 100 мл. Стерилизация - 115^oC 30 минут.

Гриб культивируют на чашках Петри (диаметр 9 см) в темноте при 28^oC 7 суток.

Семисуточные колонии на голодном агаре 12-15 мм в диаметре, белые, пушистые с немногочисленными гифальными клубочками, нарастают мелкими лопастями в виде неправильной розетки с линейной скоростью 1,5-2 мм в сутки; с развитым воздушным вегетативным мицелием, хлопьевидно-пушистые 0,4-0,6 см высотой; хорошо спороносящие. Строение и размеры спорангиеносцев, спорангий и спорангиеспор аналогичны примеру 4.

Пример 7. Культурально-морфологические признаки на среде Чапека.

Состав среды (г/л) - сахароза - 30,0, NaNO₃ - 2,0, K₂HPO₄ -1,0, KCl - 0,5, MgSO₄ • 7H₂O - 0,5, FeSO₄ • 7Н₂O - 0,01, агар - 20, вода дистиллированная - 1000 мл.

Гриб культивируют на чашках Петри (диаметр 9 см) в темноте при 28^oC 7 суток.

Семисуточные колонии на среде Чапека 15-20 мм в диаметре, белые, пушистые с немногочисленными гифальными клубочками, нарастают мелкими лопастями в виде неправильной розетки с линейной скоростью 2-2,8 мм в сутки; с развитым воздушным вегетативным мицелием, хлопьевидно-пушистые 0,5-0,6 см высотой; слабо спороносящие. Строение и размеры спорангиеносцев, спорангий и спорангиеспор аналогичны приведенным в примере 4.

Физиолого-биохимические признаки штамма Mortierella alpina Peyronel БС-2 (ВКМ F-3625Д):
Штамм сапрофит, аэроб, растет в диапазоне pO₂ от 10 до 100% от насыщения воздухом, не растет в анаэробных условиях.

Способен расти в интервале от 5 до 32^oC. Оптимальная температура для роста 24-28^oC. Растет в интервале pH от 5,4 до 8,0, оптимальное значение pH 6,0-7,2.

Утилизирует крахмал, глюкозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, маннозу, декстрин, галактозу, гликоген, аммонийные формы азота, нитраты, аминные формы азота (пептоны, дрожжевой экстракт, гидролизаты мясной, рыбной муки, казеина).

Техническим результатом изобретения является получение штамма, вырабатывающего относительно большее количество арахидоновой кислоты в составе жирных кислот (до 62%), а также продуцирующего кислоты C_20:5 - C_22:6, в зависимости от условий культивирования.

Сравнительная продуцирующая способность родительского и нового штаммов по выходу жирных кислот приведена в примере 8.

Пример 8. Содержание высших жирных кислот (отн.%) в образцах экстрактов, полученных из мицелиальной биомассы штаммов Mortierella alpina Peyronel БС-1 и БС-2 при выращивании на различных средах (табл. 1).

Штамм отличается от родительского более высоким содержанием арахидоновой кислоты (C 20:4, ω-6) от суммы жирных кислот: до 62% против 34%. Кроме того, штамм БС-2 позволяет выращивать биомассу до 25 г/л против 14 г/л - в случае использования штамма БС-1.

Повышение уровня более ненасыщенных и длинных высших жирных кислот, типа эйкозапентаеновой (C 20:5, ω-3) и докозагексаеновой (C 22:6, ω-3) может достигаться путем изменения температуры культивирования штамма, а именно путем ее снижения до 12^oC в последние сутки (пример 9).

Пример 9. Содержание высших жирных кислот (отн.%) в образце экстракта, полученного из мицелиальной биомассы гриба Mortierella alpina БС-2, после его культивирования при 12^oC (выращивание на среде 1) (табл. 2).

Выделенный из биомассы штамма экстракт используется непосредственно в виде моно-, ди-, триглицеридов и других липидов или после омыления и химической модификации, например, в виде солей, эфиров, амидов и других производных полиненасыщенных высших жирных кислот, для производства различных препаратов, применяемых в сельском хозяйстве, в ветеринарии, в медицине, в косметологии и в пищевой промышленности.

Изобретение относится к промышленной микробиологии. Новый штамм Mortierella alpina Peyronel БС-2 (VKM F-3625D) продуцирует липиды с высоким содержанием полиненасыщенных высших жирных кислот (ПНВЖК), в частности арахидоновую (С 20 : 4, W - 6) кислоту до 60 - 65%. Штамм продуцирует также эйкозапентаеновую (С 20 : 5, W - 3) и докозагексаеновую (С 22 : 6, W - 3) кислоты. Смесь ПНВЖК используют при производстве различных препаратов, применяемых в сельском хозяйстве, в ветеринарии, в медицине, в косметологии и в пищевой промышленности. Высокий уровень продуцирования арахидоновой кислоты обеспечивает перспективность использования штамма. 2 табл.

Штамм гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2 (VKM F-3625D) для производства полиненасыщенных высших жирных кислот и их производных.