СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ВЫСШИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 1999 года по МПК C12P7/64 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к области липидов, в частности, к получению полиненасыщенных высших жирных кислот.

Полиненасыщенные высшие жирные кислоты (ПНВЖК) и их производные используют для производства различных препаратов, применяемых в сельском хозяйстве, ветеринарии, медицине, косметологии и пищевой промышленности.

Наиболее биологически активным компонентом ПНВЖК является арахидоновая кислота.

Традиционными сырьевыми источниками для получения ПНВЖК и их производных являются липиды животного происхождения.

Известен способ получения этиловых эфиров ПНВЖК, согласно которому водную эмульсию липидов омыляют водно-спиртовым раствором щелочи, и образующиеся жирные кислоты подвергают ступенчатой низкотемпературной кристаллизации из ацетона или кристаллизации с мочевиной. Фракцию ненасыщенных жирных кислот далее этерифицируют этиловым спиртом при кипячении в присутствии кислотных катализаторов; полученные этиловые эфиры жирных кислот фракционируют перегонкой в вакууме (авторское свидетельство СССР N 247461, A 61 K 31/20, 1969).

Недостатками этого способа являются его многостадийность и высокая трудоемкость, обусловленные низким качеством исходного сырья. Кроме того, высокотемпературная фракционная перегонка приводит к интенсивной окислительной деструкции ПНВЖК и снижает выход целевого продукта до 30-40%.

Известны способы выделения жирных кислот из липидов, получаемых микробиологическим синтезом (патент СССР N 1822411, C 12 P 7/62, патент Республики Беларусь N 1485, A 61 K 31/23, 1996).

Бактериальную биомассу культуры Metylococcus capsulatus ВКМ14-1743 (патент СССР N 1822411, C 12 P 7/62) с содержанием жирных кислот 20% (в пересчете на сухое вещество) и влагой 75% обрабатывают спиртом этиловым в соотношении 5:1-5:10. Полученную смесь выдерживают при перемешивании 20-25 суток. В качестве катализатора синтеза жирных кислот используют внутриклеточный фермент липазу из этой же биомассы. Целевой продукт экстрагируют хлороформом и выделяют адсорбционной хроматографией. Выход жирных кислот составляет от 30 до 52% от содержания в биомассе.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ПНВЖК и их производных из мицелиальной массы гриба Entomorphtora virulenta (патент Республики Беларусь N 1485, A 61 K 31/23, 1996, прототип).

Липиды биомассы путем омыления переводят в водорастворимые соли ПНВЖК, сепарированием отделяют биомассу, раствор нейтрализуют соляной кислотой, выделяют жирные кислоты и этерифицируют в присутствии ацетила хлористого.

Выход целевого продукта от 83 до 85%, содержание эфиров жирных кислот от 89 до 95%.

К недостаткам указанного способа следует отнести:
- неэкономичность технологии, обусловленную низким содержанием липидов в исходной биомассе (до 30% на сухое вещество);
- наличие такой трудо- и энергоемкой стадии, как отделение омыленной биомассы сепарированием;
- значительное (до 11%) количество примесей в целевом продукте;
- невысокое содержание арахидоновой кислоты (15-20%).

Целью данного изобретения является создание малостадийной экономичной технологии получения ПНВЖК и их производных, увеличение выхода и улучшение качества продукта за счет исключения примесей и увеличения содержания арахидоновой кислоты.

Поставленная цель достигается предложенным способом получения ПНВЖК и их производных из микробной биомассы путем перевода ее липидной фракции в водорастворимые соли жирных кислот с последующим отделением их от биомассы и нейтрализацией соляной кислотой, отличие которого состоит в использовании в качестве биомассы мицелиальной массы гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2.

Штамм получен путем отбора моноспорового изолята после воздействия ультрафиолетом на суспензию спор Mortierella alpina БС-1 (VKM F-3605D). Авторский номер нового штамма БС-2. Хранится во Всероссийской Коллекции микроорганизмов под международным депозитарным номером VKM F-3625D. В данное время штамм является производственным.

Штамм имеет следующие культурально-морфологические особенности.

На сусле-агаре при 28^oC культура семидневной колонии белая. Высота воздушного мицелия 5-8 мм. Скорость роста мицелия на чашках Петри при 28^oC составляет 6-7 мм в сутки. Температурный оптимум для роста мицелия 28^oC. От места инокуляции агаровой среды мицелий распространяется концентрическими зонами или мелкими лопастями в виде неправильной розетки. Гифы бесцветные, их ширина 5-7 мкм, длина 10-60 мкм. Слабо спороносят на сусле-агаре, хорошо на голодном агаре. Спорангиеносцы шиловидные 60-150 мкм, диаметр у верхушки 2-4 мкм, у основания 6-10 мкм, с клеткой-ножкой, простые, отходят от субстрата. Спорангии округлые, с бугристыми выступами, у основания часто слегка приплюснутые, диаметр 10-20 мкм, многоспоровые. Спорангиоспоры эллиптическо-цилиндрические 4-5,5 х 1,5-2,5 мкм, обычно с 1-2 каплями жира.

Штамм хранят на глюкозокартофельном агаре или сусле-агаре при 0-4^oC в течение 6 месяцев, или в виде суспензии мицелия в 10%-ном растворе глицерина при (-40)-(-70)^oC.

Штамм размножается вегетативным способом на сусле-агаре или глюкозокартофельном агаре при 28^oC.

Штамм-аэроб, сапрофит, не растет при 37^oC.

Штамм культивируют при температуре 24-28^oC в колбах на средах различного состава, на качалке при 220 об/мин в течение 5-7 суток. Наилучшие результаты получены при следующем составе питательной среды, г/л:
Глюкоза - 80
Пептон - 10
Дрожжевой экстракт Ditco - 5
KH₂ PO₄ - 2
MgSO₄ - 0,5
При таком способе культивирования мицелиальная масса гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2 содержит от 45 до 55% липидов (в пересчете на сухое вещество), на 90% состоящих из ПНВЖК. Содержание арахидоновой кислоты в ПНВЖК достигает 65%.

Липиды биомассы омыляют, натриевые соли жирных кислот отделяют от биомассы фильтрацией под вакуумом и нейтрализуют соляной кислотой. ПНВЖК либо выделяют и очищают фильтрацией через силикагель и оксид алюминия, либо используют для получения производных, например, эфиров.

Выход целевого продукта достигает 90% от содержания ПНВЖК в биомассе, содержание ПНВЖК в продукте 99,0±0,5%.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения предлагаемого способа.

Пример 1. Берут 1 кг мицелиальной массы гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2 с влагой 80% (200 г абсолютно сухого вещества), содержание липидов в сухом остатке 52%, содержание ПНВЖК в липидах 90%. Добавляют 0,5 л 6%-ного раствора гидроокиси натрия в 30%-ном этиловом спирте и выдерживают 30 мин при температуре 30^oC, после чего осадок отделяют фильтрацией, фильтрат нейтрализуют соляной кислотой до pH 5,5, отстаивают в течение 30 мин и отделяют смесь жирных кислот. Продукт очищают фильтрацией через слой силикагеля (4 г) и оксида алюминия (3 г).

Получают 84,2 г продукта с содержанием высших жирных кислот 99,5%, а ПНВЖК - более 85%. Выход ПНВЖК составляет 90,6 мас.%.

Жирнокислотный состав продукта представлен в таблице.

Пример 2. В соответствии с примером 1 получают смесь высших жирных кислот, добавляют 90 мл спирта этилового, 10 мл ацетила хлористого и в течение 2 ч ведут процесс этерификации при температуре 50^oC. Смесь нейтрализуют щелочью до pH 7,0, спирт отгоняют в вакууме (12 мм рт. ст.), продукт очищают фильтрацией через слой силикагеля (4 г) и оксида алюминия (3 г).

Получают 82,0 г продукта с содержанием эфиров высших жирных кислот 99,5%, а ПНВЖК - более 85%. Выход составляет 88,2 мас.% от содержания ПНВЖК в исходной биомассе.

Предложенный способ позволяет повысить экономичность технологии за счет использования эффективного штамма-продуцента с высоким содержанием липидов в биомассе (45- 55%), упростить процесс за счет исключения трудо-и энергоемкой стадии сепарирования и получить целевые продукты, практически не содержащие примеси.

Кроме того, предложенный способ позволяет получить целевые продукты с высоким содержанием арахидоновой кислоты (62%).

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ основан на превращении липидной фракции микробной биомассы гриба Mortierella alpina Peyronel (нового штамма VКM F-3625) в водорастворимые соли жирных кислот с последующим отделением их от биомассы и нейтрализацией соляной кислотой. Способ позволяет упростить процесс, повысить качество целевого продукта и обеспечить в продукте высокое содержание арахидоновой кислоты. 1 табл.

Способ получения полиненасыщенных высших жирных кислот и их производных из микробной биомассы путем перевода ее липидной фракции в водорастворимые соли жирных кислот с последующим отделением их от биомассы и нейтрализацией соляной кислотой, отличающийся тем, что в качестве биомассы используют мицелиальную массу гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2 (VКМ F-3625).