ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS SPECIES MFN, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa, PAO, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, которые утилизируют отдельные углеводороды из состава нефти (патент США N 3813316, кл. 195-28, 1974 г.). Недостатком его является нестабильность и потеря плазмид из клеток бактерий.

Широко применяется штамм Pseudomonas putida 36 (а.с. СССР N 1076446, C 12 N 15/00, 1984 г.), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что он растет и утилизирует нефтепродукты лишь ири сравнительно высокой температуре (28 - 30^oC).

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (А.с. SU N 1493666-A1, 1987 г), Flavobacterium tirrennicum (А.с. SU N 1409594, 1988 г.), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetronacter sp. HB-1 (патент RU N 2077579, 1994 г.) и Acinetronacter sp. JN-2 (патент RU N 2064017, 1993 г.). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть только при высоких температурах.

Наиболее близким предлагаемому штамму является штамм Rhodococcus erythroplis E-15 (патент RU N 2019527, 1993 г.). Этот штамм утилизирует нефть при температуре 10^oC, но процесс протекает медленно, только через 4 недели биодеградация нефти достигает 32% без добавки различных удобрений.

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в относительно короткие сроки в широком диапазоне температур, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Предлагаемый штамм бактерий Rhodococcus sp. MFN выделен из нефти нефтепровода "Дружба", полученной на нефтеперерабатывающем комбинате г. Капотня Московской обл. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКМП Ас-1558.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки. Грамоположительные прямые, изогнутые палочки, часто встречаются V-формы. Размеры палочек из 24-часовой культуры 0,6 х 4,0 - 6,0 мкм, старые культуры распадаются на кокковые формы. Культура неподвижна, кислотонеустойчива.

На мясопептонном агаре через 48 часов дает мелкие, выпуклые, круглые с ровным краем колонии розового цвета по консистенции палочки пастообразные, непрозрачные, блестящие, легко снимаются с агара.

В мясопептонном бульоне растет в виде осадка на дне и пленки на поверхности.

Культура растет на минеральной среде, используя в качестве источника углерода нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. Источниками углерода могут служить пары бензина и керосина, газы пропан и бутан.

Физиолого-биохимические признаки. Факультативный аэроб, растет в температурном дипазоне от 4^oC до 40^oC оптимум 28^oC. Углеводы не окисляет и не сбраживает, кроме глюкозы и манита. Отношение к источникам азота: нитраты не восстанавливает, денитрификация отсутствует, фенилаланин не дезаменирует. протолической активностью не обладает. Оксидазоотрицательная, каталазоположительная, обладает уреазной активностью. В дополнительных факторах роста не нуждается. Не растет на среде Симмонса и на среде Мак-Конки.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Генетические особенности. Культура устойчива к антибиотикам: полимиксину, новобиоцину и бацитроцину. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлоа: Mn(II), Ni - 10 мг/л, Zn - 100 мг/л, Mo - 100 мг/л, Cu, Cr (IV), Cr (VII) - 20 мг/л, Pb - 100 мг/л, Fe - 100 мг/л, Ag - 10 мг/л.

Условия хранения: в лимофилизированном виде а ампулах при 4^oC. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на минеральной среде 8E с нефтью и нефтепродуктами, а также на полноценной среде.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Rhodococcus sp. MFN выращивают на минеральной среде 8E следующего состава, г/л: (NH₄)₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,7; NaCl - 0,5; MgSO₄ • 7H₂O - 0,8; дистиллированная вода - 1 л; pH 7,2. В качестве единственного источника углерода добавляют 1% ксенобиотика. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды и 300 мг нефти, мазута и керосина отдельно в каждую. колбы засевают клетками предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтепродуктом и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, 10^oC и 28^oC в течение 10 дней. Биодеградацию определяют на газовом хроматографе. Данные эксперимента показывают, что предлагаемый штамм уже на пятый день при 10^oC утилизирует соответственно 29%, 16%, 41% и 64% нефти, мазута, дизельного топлива и керосина, а при 28^oC соответственно 81,5%, 26,1%, 74,0%, 95,3%.

Пример 2. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды E8 и 1% смеси углеводородов нефти (нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан). Колбы инфицируют исследуемой культурой в концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контрольную колбу оставляют неинфицированной. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, 20^oC в течение 5 дней. Обработку результатов проводят на газовом хроматографе. Результаты показывают, что биодеградация указанных углеводородов прошла на 77,8%, 53,8%, 56,2%, 63,9%, 42,1% и 43,7% соответственно по сравнению с контролем.

Пример 3. В колбы на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды E8, 300 мл нефти, 10 мг/л солей Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Ni, Ag, и Cr - 50 мкг/л и клетки предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контролем служит колба, в которую вносят нефть и клетки бактерий. Опыт проводят в трех повторностях. Культивируют колбы на качалке при 28^oC при 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты опыта показывают, что в колбе с солями металлов и без них клетки предлагаемого штамма утилизируют нефть на 51%.

Пример 4. Исследуемую культуру наносят петлей на чашки Петри с голодным агаром и ставят в эксикаторы с газами пропаном и бутаном, которые служат единственным источником углерода, а также с парами бензина и керосина. Учет результата и пересев осуществляют через 5 дней культивирования. Результаты показывают, что предлагаемая культура Rhodococcus sp. MFN выдерживает 10 и более пересевов, утилизируя газообразные источники углерода. Данных по утилизации газообразных углеводородов нефти штаммом-прототипом нет.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он относительно быстро утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо и керосин как при температуре 28^oC, так и при 10^oC. Утилизирует такие углеводороды нефти, как нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан и пристан. Штамм может утилизировать углерод из газов пропан и бутан, а также из паров бензина и керосина. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов, что расширяет диапазон его применения при очистке территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Выделен новый штамм бактерий Rhodococcus species MFN из нефти нефтепровода "Дружба", депонирован в ВКПМ под Ас-1558. Данный штамм утилизирует нефть, мазут, керосин, нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан, пары бензина и керосина, а также газы пропан и бутан в качестве единственного источника углерода. Процесс идет в широком диапазоне температур, уже на 5-е сутки нефтепродукты утилизируются на 75-95%. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Mn, Ni, Zn, Mo, Cr, Сu, Fе, Рb, Аg.

Штамм бактерий Rhodococcus species MFN, депонирован в ВКПМ АС-1558, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.