ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 C12N1/20 B09C101/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa 121, утилизирующий октан (коллекция музея лаборатории внехромосомной наследственности ИБФМ АН СССР, 1976). Недостатком штамма является узкий спектр утилизируемых нефтепродуктов.

Такой же избирательностью обладает известный штамм Pseudomonas aeruginosa 123, несущий плазмиды Oct, Nah, Cam (a.c. N 612958, кл. C 12 N 15/09, 1978).

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa PAO, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, контролирующий утилизацию отдельных углеводородов из состава нефти (патент США N 3813316 кл. 195-28, 1974). Недостатком вышеупомянутого штамма является низкая скорость утилизации сырой нефти.

Недостатком штамма Pseudomonas putida 36 (a.c. N 1076446, кл. C 12 N 15/00, 1984), является то, что он растет и утилизирует нефть при достаточно высокой температуре (30^oC). Процент утилизации нефти у Pseudomonas putida 36 cоставляет 68 74% за 30 суток.

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, способного осуществлять деградацию нефти и нефтепродуктов, который может быть использован при очистке водоемов, загрязненных нефтью и ее продуктами, при очистке почв, загрязненных мазутом. Поставленная задача решается получением штамма бактерий, утилизирующего нефть и нефтепродукты при различных диапазонах температуры и в более короткие сроки. Штамм бактерий Acinetobaster sp HB выделен из мазута М-40 и депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Государственного концерна "Биопрепарат" ЦКМК "Б" под номером ЦКМ В-56 Б.

Предлагаемый штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки: грамотрицательные аэробные коккобациллы 1,0 1,5 х 1,5 2,0 мк, неподвижны. В первые часы роста (до 18 часов) имеет вид коккобацилл, через сутки в основном наблюдаются кокковые формы клеток. На протных питательных средах общего назначения (МПА) через сутки образуются округлые колонии 2 6 мм, выпуклые, ровные края, маслянисто-слизистой консистенции, бесцветные.

В бульоне бактерии растут в виде однородной мути с придонным осадком. Культура хорошо растет на минеральных средах (Е-8) с добавлением 0,5 1,0% нефтепродуктов. Для получения накопительной культуры в среду с рН 5,5 6,0 вносят 0,2% ацетата натрия.

Физиологические признаки: аэроб, возможен рост в диапазоне температур от 10^oC до 41^oC, оптимальная температура 30^oC, оптимальная кислотность среды 7,0, но возможен типичный рост при рН 5,5 8,0.

Биохимические признаки. Использует глюкозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, не усваивает мальтозу, рамнозу, сахарозу, маннозу, глицерин, инозит, маннит. В качестве источника углерода может использовать цитрат, сукцинат. Денитрификация отсутствует, фенилаланин не дезаминирует, желатин и крахмал не гидролизует, обладает уреазной активностью, каталазоположительная, оксидазоотрицательная.

Отношение к углеводородам: использует парафин, вазелин, дизельное топливо, керосин, мазут (М-40 и М-100), гексадекан. При культивировании в дополнительных факторах роста не нуждается.

Штамм невирулентный и нетоксичный, относится к микроорганизмам IV класса опасности (малоопасны). Устойчив к пенициллину.

Оценку биодеградации нефти и нефтепродуктов проводили измерением веса сухого остатка.

Условия хранения. В лиофилизованном виде в ампулах при температуре 4^oC.

Пример 1. Исследуют нефтеокисляющую активность Acinetobacter sp HB-1 в отношении сырой неочищенной нефти, дизельного топлива и мазута (М-40).

В аналогичных условиях исследуют Pseudomonas putida 36 (штамм выделен из препарата путидойл).

Acinetobacter sp HB-1 выращивают на минеральной среде Е-8 следующего состава: (г/л) (NH₄)₂ HPO₄ 1,5, KH₂PO₄ - 0,7, MgSO₄ 7H₂O 0,8, NaCl 0,5, H₂O дистиллированная до 1,0 л, рН 7,0. Добавка нефти или нефтепродуктов в качестве единственного источника углерода 0,5% (1,0%). В колбу V 100 см³ вносили 20 см³ среды Е-8 и 100 мг (200 мг) углеводорода (указанного выше) и 2,2 10⁷ мкл/см³. Культивируют в первые сутки на качалке при комнатной температуре (18^oC), 100 об/мин, затем в последующие 13 суток колбы инкубируют при комнатной температуре без принудительного встряхивания, т.е. в стационарных условиях.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, углеводородом и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. По истечении 14 суток проводят анализ всех проб. Культуральную жидкость экстрагируют хлороформом, биомассу клеток удаляют, остаток нефти и нефтепродуктов высушивают до постоянного веса. Сравнивая "сухой" вес остатка нефти в контроле и опытных пробах, находят процент утилизации нефти ( см.табл.).

Как видно из таблицы, утилизирующая способность штамма Acinetobacter sp HB-1 по испытанным нефтепродуктам выше, чем Pseudomonas putida 36 при температуре 18 20^oC, особенно в отношении мазута в 6,5 7,5 раз.

Пример 2. Была проведена экспериментальная проверка эффективности штамма Acinetobacter sp HB-1 для очистки территории Бахметьевского промысла площадью 0,5 га, загрязненной нефтью. Испытание проводили с сентября 1992 г. по май 1993 года. Культуральную жидкость разбрызгивали на поверхность загрязненного водоема (23,46% исходный уровень нефтяного загрязнения водоема). Спустя два месяца после обработки визуальное наблюдение показало существенное уменьшение загрязненного участка отсутствие сплошной нефтяной пленки, остались лишь нефтяные пятна небольших размеров. Данные химического анализа свидетельствовали о значительном снижении, в 390 раз, уровня нефтяного загрязнения (0,06%). Анализ состояния обработанного участка в мае 1993 года свидетельствовал о полной очистке от нефти. Содержание нефтяных углеводородов в пробах воды и почвы составляло в среднем менее 1 мг в расчете на 1 л(кг) менее 0,0001% что не превышает ПДК для нефти в водоемах.

Полученные результаты указывают на перспективность предлагаемого штамма бактерий, возможность создания на его основе препарата для биологической очистки территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Использование: микробиология, а также очистка загрязненных водоемов и почв. Сущность изобретения: касается нового штамма бактерий, который выделен из мазута М-40. Штамм бактерий Acinetobacter species HB-1 утилизирует нефть и нефтепродукты в течение 14 суток на 65 - 75% при загрязнении 5 - 10 г/л. 1 табл.

1 Штамм бактерий Acinetobacter species ЦКМК "Б" ЦКМ В-56 Б, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.