СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/00 A01N63/04 C12N1/00 C12N1/14 C12N1/20 A61K35/66 A61K35/74 

Изобретение относится к технологии промышленной микробиологии и может быть использовано преимущественно в производстве микробиологических препаратов сельскохозяйственного назначения.

Известен способ производства микробиологических препаратов, включающий подготовку посевной культуры микроорганизмов из штамма-продуцента и питательной среды, содержащей водорастворимые углеводы, источник органического азота, соли и воду, внесение посевной культуры в питательную среду, ее культивирование и введение целевого продуцента из культуральной жидкости (заявка РСТ N 94/16566, кл. А 01 N 63/04, 1994).

Недостатком данного способа является узкая направленность способа на производство небольшой группы микробиологических препаратов сельскохозяйственного назначения из-за заданного соотношения источника органического азота и глицерина в питательной среде.

Задачей изобретения является расширение технологических возможностей. Поставленная задача решается тем, что в способе производства микробиологических препаратов, включающем подготовку посевной культуры из штамма-продуцента и питательной среды, содержащей источник органического азота и водорастворимые углеводы, соли и воду, внесение посевной культуры в питательную среду, ее культивирование и выделение целевого продуцента из культуральной жидкости, согласно изобретения, питательная среда содержит не менее 2% по массе водорастворимых углеводов и не менее 0,0003% по массе аминного азота, при этом общее количество углеводов не превышает 18% по массе, а общий азот составляет не более 2,7% по массе.

Это позволяет расширить технологические возможности способа за счет расширения ассортимента микробиологических препаратов различного назначения на основе большого количества микроорганизмов, в том числе не относящихся к микробиологическим грибам.

В предпочтительном варианте в качестве источника органического азота питательная среда содержит гидролизат и/или автолизат дрожжей и/или рыбокостной муки и/или казеина и/или белково-витаминный концентрат.

Это позволяет получить питательные среды с наиболее универсальным составом, обеспечивающим оптимальное соотношение содержания общего и аминного азота.

В другом предпочтительном варианте культивирование осуществляют глубинным методом. Это позволяет наиболее полно использовать химические вещества питательной среды и получить препараты с максимальным содержанием активного начала.

В этом случае предусмотрена возможность использования для культивирования микроорганизмов вида Salmonella enteritidis var Issatschenko (Danitsch-Mereshkovsky) и смешивание культуральной жидкости с зерновой основой в виде пересушенного зерна или муки и вкусо-ароматической приманкой, при этом в случае использования в качестве зерновой основы муки после смешивания препарат экструдируют и сушат.

Это позволяет получить товарные формы бактороденцида с высоким содержанием активного начала для использования в закрытых помещениях и на открытых площадках и полях в целях борьбы с вредными насекомыми и мышевидными грызунами.

В этом же случае предусмотрена возможность использования для культивирования микроорганизмов вида Streptomyces albolongus или Streptomyces longosporus или Streptomyces avermitilis. При этом для получения жидкой формы препарата возможно ведение культивирования до максимального накопления мицелиальной массы или спорообразования, концентрирования культуральной жидкости до содержания сухих веществ 6 10% по массе и введение в концентрат 4 10% по массе глицерина и 0,1 1,0% полиэтиленоксида или 1 3% поливинилпирролидона по массе; для получения сухого препарата возможно ведение культивирования до максимального спорообразования, концентрирования культуральной жидкости до содержания сухих веществ 20 30% по массе, введение в концентрат смеси цеолита типа NaX и монтмориллонита или полыгорскита в соотношении 1 2 в количестве 10 30% по массе к сухим веществам концентрата, гранулирование и сушка смеси; для получения комбинированного препарата с удобрением культуральную жидкость вводят в созревающий или зрелый биогумус.

Это позволяет получить препараты для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми.

В этом случае возможно использование для культивирования микроорганизмов вида Trichoderma lignorum или Trichoderma harzianum или Trichoderma koningii и смешивание культуральной жидкости с созревающим или зрелым биогумусом.

Это позволяет получать комбинированный с удобрением препарат для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми.

Способ реализуется следующим образом.

Посевную культуру микроорганизмов готовят из штамма-продуцента. Одновременно готовят питательную среду, содержащую водорастворимые углеводы, источник органического азота, соли и воду. В состав питательной среды источники углеводов и органического азота вводят таким образом, чтобы обеспечить содержание водорастворимых углеводов не менее 2% по массе и не менее 0,0005% по массе аминного азота и не более 18% по массе общего содержания углеводов и общего азота не более 2,7% по массе. В предпочтительном варианте в качестве источника органического азота в питательную среду вводят гидролизат и/или рыбокостной муки и/или казеина и/или белково-витаминный концентрат, которые обеспечивают оптимальное сочетание содержания общего и аминного азота. Далее посевную культуру вводят в питательную среду и осуществляют ее культивирование, в предпочтительном варианте глубинным методом.

При культивировании используют предпочтительно микроорганизмы вида Salmonella enteritidis var Issatschenko (Danitsch-Mereshkovsky) или Streptomyces albolongus или Streptomyces longosporum или Streptomyces avermitilis или Trichoderma lignorum или Trichoderma harzianum или Trichoderma koningii. В случае использования микроорганизмов вида Salmonella enteritidis var Issatschenko (Danitsch-Mereshkovsky) после завершения культивирования готовят бактероденцид путем смешивания культуральной жидкости с зерновой основой и вкусо-ароматической приманкой. Этот препарат может быть выпущен в виде формы для применения в любых условиях, в том числе на открытых площадках и полях, когда в качестве зерновой основы используют пересушенное зерно, а также в виде формы для применения только в закрытых помещениях, когда в качестве зерновой основы используют муку, а затем смесь культуральной жидкости с мукой экструдируют и сушат.

В случае использования для культивирования микроорганизмов рода Streptomyces названных выше видов культивирование можно осуществлять до максимального накопления мицелиальной массы или спорообразования. Культуральная жидкость после выращивания микроорганизмов до максимального накопления мицелиальной массы в основном пригодна для производства жидкой товарной формы препарата для борьбы с фитопатогенными организмами или смешивания с созревающим биогумусом.

После максимального спорообразования культуральную жидкость используют для производства сухих товарных форм аналогичных препаратов длительного хранения, в том числе и в сочетании со зрелым биогумусом.

При использовании микроорганизмов рода Trichoderma названных выше видов культуральную жидкость смешивают с биогумусом, при этом в зависимости от степени развития микроорганизма следует выбирать биогумус созревающий или зрелый, аналогично тому, как это описано для микроорганизмов рода Streptomyces.

Пример 1.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Salmonella enteritidis var Issatschenko (Danitsch-Mereshkovsky) N 18/1. Питательная среда содержит автолизат и сернокислотный гидролизат дрожжей, сернокислотный гидролизат рыбокостной муки, белково-витаминный концентрат, глюкозу, зеленую патоку, мел и воду. Содержание в ней водорастворимых углеводов составляет 2,3% по массе, общее содержание углеводов 2,5% по массе, аминного азота 0,12% по массе, общего азота 1,8% по массе. Среду стерилизуют и засевают посевной культурой. Культивирование осуществляют глубинным методом при перемешивании и аэрации при температуре 36^oС в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральную жидкость смешивают с зерном, высушенным в псевдоожиженном слое при температуре 105^oС в течение 24 часов, и подсолнечным маслом, используемым в качестве вкусо-ароматической приманки. Готовый зерновой препарат содержит около 10х10⁹ клеток на 1 г.

Пример 2.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Salmonella enteritidis var Issatschenko (Danitsch-Mereshkovsky) N 29/1. Питательную среду готовят из солянокислого гидролизата казеина, белково-витаминного концентрата, технической глюкозы, хлорида натрия, мела и воды. Она содержит водорастворимых углеводов 3% по массе, всего углеводов 3,2% по массе, аминного азота 0,13% по массе, общего азота 1,1% по массе. Среду стерилизуют и засевают посевным материалом. Культивирование осуществляют глубинным методом при перемешивании и аэрации при температуре 37^oС в течение 36 часов. Культуральную жидкость смешивают с мукой, отрубями и кукурузным маслом, используемым в качестве вкусо-ароматической приманки. Смесь экструдируют и сушат. Полученный препарат представляет собой гранулы с содержанием микробиальных клеток около 9х10⁹ на 1 г.

Пример 3.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Streptomyces albolongus ОСТ-5 ЦКМ-F-62 Ц. Для получения питательной среды смешивают соевую муку, глюкозу, кукурузный экстракт, белково-витаминный концентрат, карбонат кальция и воду. Она содержит водорастворимых углеводов 2% по массе, всего углеводов 5,3% по массе, аминного азота 0,06% по массе, общего азота 2,7% по массе. Среду стерилизуют и вносят в нее посевную культуру. Культивирование осуществляют глубинным методом до максимального накопления мицелиальной массы при температуре 28^oС, после чего концентрируют культуральную жидкость до содержания сухих веществ 10% по массе и вводят в концентрат 30% по массе сухих веществ цеолита типа NaX и полыгорскита в соотношении 1 2, гранулируют смесь и сушат. Получают сухое средство с содержанием около 5х10⁹ спор на 1 г препарата.

Пример 4.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Streptomyces legosporum "ВЕРПА". Питательную среду готовят путем смешивания глюкозы картофельного пюре, белково-витаминного концентрата, азотно-кислого натрия, хлористого калия и воды. Она содержит водорастворимых углеводов 3% по массе, всего углеводов 9% по массе, аминного азота 0,012% по массе, общего азота 0,028% по массе. Среду стерилизуют и вносят в нее посевной материал. Культивирование осуществляют глубинным методом до максимального спорообразования при температуре 28^oС. Культуральную жидкость смешивают со зрелым биогумусом, подсушивают и фасуют в крафт-мешки, получен комбинированный препарат удобрения, содержащий около 1,2х10⁷ спор на 1 г.

Пример 5.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Streptomyces avermitilis АС 1301 ВКМ-РФ. Питательную среду готовят смешиванием глюкозы, люпиновой муки, овсяной муки, хлористого кальция, сернокислого железа и воды. Она содержит водорастворимых углеводов 4,1% по массе, всего углеводов 11% по массе, аминного азота 0,0008% по массе, общего азота 0,015% по массе. Питательную среду стерилизуют и вносят в нее посевную культуру. Культивирование осуществляют глубинным методом до максимального накопления мицелия и начала спорообразования при температуре 30^oС. Культуральную жидкость концентрируют до содержания сухих вещество 10% по массе и вводят в концентрат 4% по массе глицерина и 0,1% полиэтиленоксида. Получен жидкий препарат с содержанием авермектинов около 1% по массе.

Пример 6.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Trichoderma lignorum ТБД-93. Питательную среду готовят из технической глюкозы, гидролизата дрожжей, азотнокислого натрия, однозамещенного фосфорнокислого натрия, хлористого калия, сернокислого железа и воды. Она содержит водорастворимых углеводов 2,8% по массе, всего углеводов 2,801% по массе, аминного азота 0,0005% по массе, общего азота 0,0006% по массе. Среду стерилизуют, вносят в нее посевную культуру и осуществляют культивирование глубинным методом при температуре 26^oС в течение 96 часов. Культуральную жидкость смешивают с зрелым биогумусом. Получен сухой препарат с содержанием спор 2,1х10⁷ на 1 г.

Пример 7.

Посевной материал готовят из штамма-продуцента Trichoderma hurzianum 2029. Для приготовления питательной среды смешивают автолизат дрожжей, мелассу, азотнокислый аммоний, мел, хлорид натрия, сернокислое железо и воду. Она содержит водорастворимых углеводов 2,1% по массе, всего углеводов 2,104% по массе, аминного азота 0,03% по массе, общего азота 0,08% по массе. Среду стерилизуют, вносят в нее посевной материал и осуществляют культивирование глубинным методом в течение 48 часов при температуре 27^oC, культуральную жидкость смешивают с созревающим биогумусом и продолжают культивирование в течение 168 часов. Получен препарат с содержанием 10х10⁶ спор на 1 г.

Пример 8.

Посевной материал готовят из штамма-продуцента Trichoderma koningii ИБФМ F240. Питательную среду составляют из гидролизата дрожжей, муки арахиса, кукурузного экстракта, пюре топинамбура, зеленой патоки, нитратов магния и аммония, хлорида кальция и воды. Она содержит водорастворимых углеводов 2,1% по массе, всего углеводов 12% по массе, аминного азота 0,3% по массе, общего азота 1,08% по массе. Среду стерилизуют, вносят в нее посевную культуру и осуществляют культивирование глубинным методом в течение 30 часов при температуре 27^oС. Культуральную жидкость смешивают со зрелым гумусом. Получен препарат с содержанием 2х10⁷ клеток на 1 г.

Пример 9.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Entomophthora thaxteriana 65-41-15.

Для приготовления питательной среды смешивают соевую муку, глюкозу, молочную сыворотку, хлорид натрия и воду. Она содержит водорастворимых углеводов 6% по массе, всего углеводов 7,1% по массе, аминного азота 0,04% по массе, общего азота 0,4% по массе. Питательную среду стерилизуют, вносят в нее посевную культуру и осуществляют глубинное культивирование при температуре 25,5^oС в течение 153 часов. Культуральную жидкость концентрируют до содержания сухих веществ 25% по массе, смешивают с цеолитом, гранулируют и сушат, получен препарат с содержанием 1х10⁵ спор на 1 г.

Пример 10.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Bacillus subtilis G-28. Для приготовления питательной среды смешивают соевый жмых, мясокостный бульон, глюкозу, крахмал, сульфат аммония и воду. Она содержит водорастворимых углеводов 4,58% по массе, аминного азота 0,2% по массе, всего углеводов 10% по массе, общего азота 0,9% по массе. Питательную среду стерилизуют, вносят в нее посевную культуру и осуществляют глубинное культивирование с аэрацией 0,4 л/мин при температуре 32^oC в течение 26 часов. Культуральную жидкость отделяют и сушат с получением ферментного препарата медицинского назначения лизоцим.

Пример 11.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Aspergillus niger П. Для приготовления питательной среды смешивают свекловичный жом, солодовые ростки, стержни початков кукурузы, кислый фосфат аммония, однозамещенный фосфат калия, сульфат магния и воду. Она содержит водорастворимых углеводов 2,72% по массе, аминного азота 0,02% по массе, всего углеводов 14% по массе, общего азота 0,204% по массе. Питательную среду стерилизуют, вносят в нее посевную культуру и осуществляют культивирование глубинным методом при температуре 30^oС в течение 72 часов. Культуральную жидкость отделяют и сушат с получением пектолитического ферментного препарата для осветления соков или обработки мезги перед извлечением из нее сока в консервной промышленности или виноделии.

Пример 12.

Посевную культуру готовят из штамма-продуцента Lactobacillus plantarum S-68. Для приготовления питательной среды смешивают гидролизованное молоко, дрожжевой автолизат, агар-агар, мел, сульфат марганца (II), сульфат железа (II) и воду. Она содержит водорастворимых углеводов 6% по массе, аминного азота 2,1% по массе, всего углеводов 6,2% по массе, общего азота 2,7% по массе. Питательную среду стерилизуют, вносят посевную культуру и осуществляют глубинное культивирование при температуре 30^oС в течение 148 часов. Биомассу отделяют от культуральной жидкости с получением закваски для соления овощей с содержанием 10¹¹ клеток на мл.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет расширить технологические возможности за счет увеличения ассортимента производимых микробиологических препаратов.

Использование: промышленная микробиология. Сущность: предложен способ производства микробиологических препаратов, который предусматривает подготовку посевной культуры микроорганизмов из штамма-продуцента и питательной среды, содержащей водорастворимые углеводы, источник органического азота, соли и воду, в которой содержание водорастворимых углеводов не менее 2% по массе, аминного азота не менее 0,0005% по массе, всего углеводов не более 18% по массе, общего азота не более 2,7% по массе, внесения посевной культуры в питательную среду, ее культивирование и выделение целевого продукта из культуральной жидкости. 10 з.п. ф-лы.

1 1. Способ производства микробиологических препаратов, включающий подготовку посевной культуры микроорганизмов из штамма-продуцента и питательной среды, содержащей водорастворимые углеводы, источник органического азота, соли и воду, внесение посевной культуры в питательную среду, ее культивирование и выделение целевого продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что питательная среда содержит не менее 2 мас. водорастворимых углеводов и не менее 0,005 мас. аминного азота, при этом общее количество углеводов не превышает 18 мас. а общий азот составляет не более 2,7 мас.2 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника органического азота среда содержит гидролизат, и/или автолизат дрожжей, и/или рыбокостной муки, и/или казеина, и/или белково-витаминный концентрат.2 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что культивирование осуществляют глубинным методом. 2 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что для культивирования используют микроорганизмы вида Salmonella enteritidis var I&satschenko (Danitsch Merezhkovsky), при этом культуральную жидкость смешивают с зерновой основой и вкусоароматической приманкой.2 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве зерновой основы используют пересушенное зерно.2 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве зерновой основы используют муку, при этом после смешивания препарат экструдируют и сушат.2 7. Способ по п.3, отличающийся тем, что для культивирования используют микроорганизмы вида Streptomyces albolongus, или Streptomyces longosporus, или Streptomyces avenrmitilis. 2 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что культивирование осуществляют до максимального накопления мицелиальной массы или спорообразования, а культуральную жидкость концентрируют до содержания сухих веществ 6 10 мас. и вводят в концентрат 4 10 мас. глицерина и 0,1 1,0 мас. полиэтиленоксида или 1 3 мас. поливинилпирролидона.2 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что культивирование осуществляют до максимального спорообразования, а культуральную жидкость концентрируют до содержания сухих веществ 20 - 30 мас. и вводят в концентрат смесь цеолита типа NaX и монтмориллонита или полыгорскита в соотношении 1 2 в количестве 10 - 30 по массе к сухим веществам концентрата, при этом смесь гранулируют и высушивают.2 10. Способ по п.7, отличающийся тем, что культуральную жидкость вводят в созревающий или зрелый биогумус.2 11. Способ по п.3, отличающийся тем, что для культивирования используют микроорганизмы видов Trichoderma elgnorum, или Trichoderma hazzianum, или Trichoderma koningii, а культуральную жидкость смешивают с созревающим или зрелым биогумусом.