Способ получения -лейцина Советский патент 1977 года по МПК C12D13/06 

1

Изобретение относится к способу получения L-лейцина при выраодивании продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде в микробиологической промышленности и используется также в качестве питательной добавки к пиш.евым продуктам и корму животных и как компонент питательных смесей и реактивов в медицине, фармацевтической и химической промышленности.

Известны способы получения L-дейцина путем вырашивания продуцирующих его микроорганизмов из рода Brevibacterium и Соrynebacterium 1, 2.

В этих способах в качестве продуцентов L-лейцина применяют мутантные цлтаммы микроорганизмов Сог. glutamicum, Вг. flavum, Сог. acetoacidophilum, Br. lactofermentum, генетические свойства которых обеспечивают сверхсинтез L-лейцина и накопление его в питательной среде, а именно: относительную потребность для роста в изолейцине, метионине, фенилаланине, валине или их смеси; резистентность к антагонистам лейцина, в частности 2-тиазолаланину и 4-алазейцину; сочетание потребности для роста в треонине, изолейцине и метионине с резистентностью к ретроингибированию лейцином и его антагонистами, в частносги 2-тиазолаланпном и /(-окснлейцином, фермента 1 а-изопропилмалатсинтетазы.

При получении указанных мутантных штаммов в качестве исходных штаммов были использованы штаммы дикого типа, известные как продуценты глутаминовой кислоты.

Уровень накопления L-лейцина известными штаммами составляет 4-22,1 г/л, причем наиболее продуктивными являются мутанты, отселекционированные антагонистами лейцина, синтез которых сложен, а их стоимость значительна.

В известных способах в питательные среды необходимо в качестве источников роста донолнительно вводить различные гидролиаты белка, в частности соевой муки, микроб ной массы, казеина, а также экстракты дрожжей или печени.

Наиболее близким решением к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения L-лейцина нутем глубинного выращивания продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium flavum на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы, источник азота, минеральные соли и источник ростовых веществ 3J. Однако такой способ сложен, так как требует использования допо;1нительного оборудования для гидролиза белковых продуктов, и дорогостоящий за счет использования в оелекции штамма-продуцента дорогих реактивов (антагонистов лейцина). С целью упрощения и удешевления саособа предложено из микроорганизмов Brevibacterium flavum использовать штамм ВНИИгенетика-758, при селекции которого не применяют антагонистов лейцина, а отбирают первичный продуцент среди ревертантов ,к гомосериннезависимости у штаммапродуцента-лизина и затем вводят отобранному ревертанту мутацию зависимости от витамина Bia (или метиовина), что позволяет при культивировании этого штамма и получении лейцина использовать в питательных средах в качестве источника ростовых веществ кормовой концентрат витамина В la или кормобактерин. Способ заключается в следующем. Культуру 1птамма Brevibaeterium flavum ВНИИгенетика-758 выращивают на агаризованной среде Хот1ингера, зате.м выссиают в предварительно простерилизованиые вместе со средой колбы на мясопептонный бульон для выращивания посевного :,1атериала. После засева культуры колбы устанавливают на круговой качалке с 220- 240 об/мин при 30°С. Готовый посевной материал вносят в колбы с ферментационной средой, содержащей ИСТОЧ1И1КИ углерода, азота, ростовых веществ и минеральные соли, при этом в качестве источника ростовых веществ используют кормовой концентрат витамина В и и;т кор.мобактерин. Все комцонепть1 среды стерилизуют под давлением, рН среды доводят до заданной до и после стерилизации. Ферментацию проводят на указанной выще качалке при 30°С. После образования L-лейцина его содержание определяют методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Silufol. Пример 1. Культуру щтамма Brevibaeterium flavum ВНИИгенетика-758 выращивают 24 ч при 30°С на агаризованной среде Хоттингера, затем петлей высевают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащие 30-100 мл мясо-пептонного бульона, включающего компоненты, вес. °/о: .мясная вода и иептон 1,0; NaCl 0,5; сахароза 1,0. Колбы вместе со средой предварительно стерилизуют в автоклаве при 0,8 атм 30 мин. После засева культуры колбы устанавливают на круговую качалку с 220-240 об/мин и выращивают посевной материал 16 ч при 30°С. Готовый посевной материал вносят 3- 10% (но объему) в колбы Эрленмейера е.мкостью 750 мл, содержащие 30 мл ферментационной среды, состава, г/л: сахароза 100; (NH,).SO, 30; КН2РО4 1,5; MgSO4 0,5; CaC.Oj 40; биотип 100 мкг/.ч или дестибиотин 300 мкг/л; кормовой концентрат витамина В; г 5,0; водопрово.аная вода. Все компоненты среды стери;тзуют при 0,8 атм 30 .мин, рН среды доводят после стерилизации стерилыц км 25%-ным растворо.м Н 7SO4 до 7,5. Ферментацию проводят на указанной выше качалке при 30°С. После 60 ч в культура.тьной жидкости образуется 13,7 г/л L-лейцина, содержание которого определяют методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Silufol после разгоики в течение 1,2 ч в системе растворителей: этилацетат, изонропанол, а.ммиак, вода в соотношении 20:20:1,5-25 и обработки 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Пример 2. Культурой щтам.ма-продуцента, выращенной на агаризованной среде согласно примеру 1, засевают колбы е.мкостью 750 мл, содержащие 30-100 мл посевной среды следующего состава, г/л: сахароза 30; (ЫН«)г5О; 15; КН,РО, 0,8; MgSO. 0,2; кукурузный экстракт 10 (по сырому весу); кормовой концентрат витамина Bi; 10; водопроводная вода. рН среды до стерилизации доводят растворо.м NaOH до 7,6---7,8, стерилизацию среды п)оводят согласно примеру 1. рН среды после стерилизации 7,0 7,2. Посевной материал выращивают на качалке при 30°С 20 ч, засев ферментационных колб и ферментацию проводят на среде и при режиме согласно примеру 1. После 65 ч в культуральной жидкости образуется 13,2 г/л L-лейцина, определяемого согласно методике примера 1. Пример 3. Выращивание посевного .материала проводят согласно примеру 1. В составе ферментационной среды по примеру 1 кор.мовой концентрат вита.мина Bi2 за.меняют 5 г/л кормобактерина. Режим стери.лизации, засев фер.ментационных колб и условия фер.ментации аналогичны примеру 1. После 72 ч культивирования образуется 10,0 г/л L-лейцина, который определяют согласно методике примера 1. Пример 4. Выращивание посевного материала проводят по примеру 1. В составе ферментационной среды иримера 1 кормовой KOHLjcHTpaT витамина Bi заменяют на 100 мкг,л чистого препарата витамина Bj и 200 .мкг/л чистого препарата витамина Bi (тиамина). Все остальные условия аналогичны примеру 1. Культивируют 72 ч, в культура;1ьной жидкости образуется 10,9 г/л L-лейцина, определяе.мого по методике примера 1. Пример 5. Выращивание посевного ма,териала проводят согласно примеру 1. В составе ферментационной среды по примеру 1 кормовой концентрат витамина заменяют на 200 мкг/л витамина Bi и 300 мкг/л метионина. Все другие условия аналогичны примеру 1. Культивируют 72 ч, получают 12,3 г/л L-лейцина в культуральной жидкости. Содержание лейцина определяют согласно методике примера 1. Описываемый способ получения L-лейцина по сравнению с известным дешев, так как не требует применения дорогостоящих реактивов и вместо чистых препаратов витаминов BI и В 12 в питательных средах могут быть использованы сухие кормовые концентраты, например кормовой концентрат витамина Bi2 или кормобактерин, и метионин, являющийся продуктом химического синтеза и выпускаемого в качестве кормовой добавки для использования в животноводстве. Описываемый способ прост, так как не требует применения оборудования для гидролиза белковых продуктов. 6 Формула изобретения Способ получения L-лейцина путем глубинного выращивания продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium flavum на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы, источник азота, минеральные соли и источник ростовых веществ, отличающийся тем, что, с целью упрощения и удещевления способа, из микроорганизмов Brevibacterium flaum используют ВНИИгенетика-758, требующий для своего развития витамин Biz или метионин, при этом в качестве источника ростовых веществ используют кормовой концентрат-витамина В|2 или кормобактерин. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1.Патент США № 3668073, кл. 195-29, 1972. 2.Патент Франции № 2264088, кл. С 12 D 13/06, 1975. 3. Патент США № 2264088, кл. С 12 D 13/06, 1975.