ШТАММ Bacillus licheniformis БСТ-1-ПРОДУЦЕНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ Российский патент 2004 года по МПК C12N9/86 C12N9/86 C12R1/10 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения фермента пенициллиназы микробиологическим синтезом.

Пенициллиназа - фермент, инактивирующий пенициллин путем расщепления бета-лактамного кольца. Ранее пенициллиназу использовали в медицинской практике при острых аллергических реакциях и анафилактическом шоке, вызванных препаратами группы пенициллина [М. Д. Машковский. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1988, т.2, с.68]. В настоящее время ее используют в аналитических целях для контроля стерильности лекарственных форм бета-лактамных антибиотиков, для чего препараты антибиотиков инактивируют с помощью пенициллиназы, высевают образцы на питательные среды и выявляют наличие роста сопутствующих микроорганизмов, если они присутствовали в исследуемых образцах. Используют пенициллиназу и для определения содержания в препаратах бета-лактамных антибиотиков активного начала.

В качестве продуцентов пенициллиназы используют различные микробные культуры, преимущественно вида Bacillus licheniformis.

Для получения пенициллиназы микробиологическим методом культуру-продуцент традиционно выращивают в подходящих условиях, отделяют микробную биомассу и выделяют фермент из фильтрата культуральной жидкости с последующей его очисткой до требуемой степени чистоты, определяемой назначением готового продукта.

Первые работы, описывающие методы получения пенициллиназы, предусматривали осаждение фермента из освобожденного от микробных клеток нативного раствора с помощью кислот [Morgan J.F., Campbell M.E.// J. Biol. Chem. - 1947. - 169. Р.337], органических растворителей [Baudet P., Hageman Y.// Experientia. 1954. - 10. - P.9374-9376; Pollock M.R., Tovriani A., Trigell E.// J. Biochem. - 1956. - 62. - Р.3], солей [Торбочкина Л.И., Могилевчик Л.Е. Выделение и некоторые свойства пенициллиназы // Антибиотики. - 1964. - 4. - С. 293].

При осаждении пенициллиназы органическими растворителями дополнительную очистку фермента осуществляли путем многократного фракционирования солями и диализа.

Общие недостатки упомянутых способов состояли в больших потерях фермента на стадиях выделения и очистки (≥70%) и в большой длительности, достигающей нескольких суток, этапа выделения пенициллиназы из фильтрата культуральной жидкости.

Цель настоящего изобретения состояла в изыскании штамма-продуцента пенициллиназы, обеспечивающего стабильный выход фермента на стадии ферментации, и в разработке упрощенного способа получения пенициллиназы, обеспечивающего при этом требуемый уровень чистоты препарата.

Поставленная цель была достигнута в результате выделения штамма Bacillus licheniformis БСТ-1, являющегося продуцентом пенициллиназы, удовлетворяющим поставленным требованиям, и в результате разработки способа получения пенициллиназы, характеризующегося тем, что культуральную жидкость, полученную на стадии ферментации, подвергают микрофильтрации на фильтре с размером пор около 0,2 мкм, а затем полученный фильтрат подвергают ультрафильтрации на фильтре, задерживающая способность которого характеризуется номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ), равной примерно 10 кДа, причем в процессе ультрафильтрации концентрат промывают солевым буферным раствором, что, в совокупности, приводит к получению целевого продукта.

Технический эффект, достигаемый при использовании предложенного штамма-продуцента, состоит в стабилизации выхода пенициллиназы на стадии ферментации, а технический эффект от использования предложенного способа заключается в значительном упрощении способа выделения пенициллиназы и достижении высокого выхода фермента при высокой степени чистоты.

Существо предложения заключается в следующем.

В качестве продуцента пенициллиназы предложен штамм Bacillus licheniformis БСТ-1, полученный из коллекционной культуры Bacillus licheniformis 749/C, депонированной в Коллекции культур микроорганизмов ГНЦА, путем ступенчатой селекции с применением в качестве селективных агентов антибиотиков стрептомицина и пенициллина.

Культуральные и морфологические свойства штамма изучали на агаризованных средах (питательный агар, среда 1, картофельный агар) путем инкубирования в термостате при температуре 34±0,5^oС в течение 24-48 часов и на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат казеина, при культивировании штамма в колбах объемом 350 мл с 35 мл среды на качалке модели G 25 фирмы New Brunswick при температуре 34±0,5^oС и при числе оборотов мешалки 280-290 об/мин в течение 17-24 часов.

Рост на плотных питательных средах
Штамм Bacillus licheniformis БСТ-1 образует колонии, имеющие на агаризованных средах следующие культуральные свойства.

Питательный агар (состав, %: ферментативный гидролизат дрожжей - 1,2; хлористый натрий - 0,55; агар -1,25; вода - 100; рН среды - 7,2-7,4)
Форма колоний на питательном агаре - округлая. Размер колоний на 1-е сутки - 0,5-2 мм, на 2-е сутки - 3-6 мм. Поверхность - блестящая, гладкая; профиль - плоский. Цвет - бледно-кремовый с кремовато-сероватым центром; край колоний - волнистый или зубчатый, реже - лопастной. Структура колоний - однородная, консистенция - слизистая.

При засеве культуры на чашки Петри с питательным агаром сплошным газоном или штрихом по краю газона или штриха иногда наблюдается ризоидный рост культуры в виде длинных нитевидных цепочек клеток.

Среда 1 (состав, %: мясопептонный бульон 1:2-100; агар-агар - 2; рН среды - 7,0-7,2)
Форма колоний - округлая. Размер колоний на 1-е сутки - от точечных до 1,5 мм, на 2-е сутки - 2,5-6 мм. Поверхность - блестящая, гладкая; профиль - плоский. Цвет колоний - серовато-белый с бледно-кремовым центром; край колоний - волнистый или зубчатый. Структура колоний - однородная, консистенция - слизистая.

Картофельный агар (состав, %: фильтрат отвара 20 г мелко нарезанного картофеля в 100 мл воды - 100; агар - 1,5-1,8; рН среды - 6,8-7,0).

Форма колоний - округлая. Размер колоний на 1-е сутки - от точечных до 1,5 мм, на 2-е сутки - 1-5 мм. Поверхность - гладкая; профиль - плоский. Цвет колоний - серовато-кремовый; край колоний - гладкий или зубчатый. Структура колоний - однородная, консистенция - слизистая.

Рост на жидкой питательной среде
При микроскопировании препарата "раздавленная капля" в процессе ферментации наблюдается скопление большого числа тонких длинных палочек. Фиксированные окрашенные препараты культуры представляют собой нитевидные цепочки плотно прилегающих друг к другу палочек.

Активность (продуктивность) штамма
Штамм образует в колбах на качалке 200-260 тыс. ЕД/мл пенициллиназы.

Генетические особенности
Штамм устойчив к присутствию в питательной среде 50 ЕД/мл стрептомицина.

Штамм Bacillus licheniformis БСТ-1 депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии наук под регистрационным номером ВКМ В-2246 Д.

Преимущества этого штамма перед другими штаммами-продуцентами пенициллиназы состоят в том, что наличие маркера (устойчивость к стрептомицину) облегчает поддерживающую селекцию штамма и позволяет готовить стандартный посевной материал и тем самым повысить стабильность биосинтеза пенициллиназы в процессе ферментации.

Исследованиями заявителя было установлено, что устойчивость штамма Bacillus licheniformis БСТ-1 к стрептомицину связана с генетическими изменениями, а именно - с изменениями в структуре 30 S - фрагмента бактериальной рибосомы.

Из литературы известно, что структурные изменения во фрагменте 30 S - бактериальной рибосомы влекут за собой репрессию синтеза экскретируемых клеткой белков [Сазыкин Ю.О. Аминогликозиды. Молекулярные механизмы взаимодействия с клеткой и пути создания новых препаратов. - В кн.: Механизмы биосинтеза антибиотиков. - М.: Наука. 1986. - С.102-115].

На этом основании, можно было предполагать, что использование штамма Bacillus licheniformis БСТ-1 как продуцента пенициллиназы может облегчить дальнейшие этапы выделения и очистки этого фермента, что связано с возможньм снижением синтеза побочных сопутствующих пенициллиназе белковых продуктов.

Стрептомицин влияет на генетическое кодирование на стадии трансляции, т. е. на стадии информационная РНК - белок. При этом происходит неправильное включение аминокислот в полипептидную цепь из-за нарушенного считывания кодонов на изменившей свою конформацию рибосоме.

Резистентность к стрептомицину обусловлена мутациями хромосомальных генов и на фенотипическом уровне выражена в ослаблении связывания антибиотика с мутантны-ми рибосомами. Частота возникновения спонтанных мутаций резистентности к стрептомицину у Bacillus licheniformis 749/C составляет 2,3•10^-6.

По сравнению с исходным чувствительным к стрептомицину штаммом Bacillus licheniformis 749/C мутантный штамм Bacillus licheniformis БСТ-1 синтезирует и экскретирует в культуральную жидкость на 24-29% меньше суммарного белка. При этом возрастает в культуральной жидкости содержание пенициллиназного белка.

Необходимо отметить, что эти соображения принимались во внимание при селекции нового штамма и из стрептомициноустойчивых клонов отбирались те, которые характеризовались пониженной белоксинтезирующей активностью.

Как показали дальнейшие исследования, эти предположения оправдались, что позволило разработать простой и эффективный способ выделения пенициллиназы.

Предлагаемый способ получения пенициллиназы заключается в следующем.

Культуру-продуцент выращивают в оптимальных для ее развития условиях на питательных средах, включающих в качестве источников углерода и азота их легко усваиваемые формы, предпочтительно гидролизаты белкового материала.

В качестве продуцентов целевого продукта могут быть использованы разные бактериальные культуры, продуцирующие пенициллиназу, но оптимальный вариант реализации предложенного способа предусматривает использование, как продуцента, штамма Bacillus licheniformis БСТ-1. В последнем случае особые свойства штамма-продуцента (пониженный уровень синтеза посторонних белков) позволяют в полном объеме проявиться преимуществам предложенного способа, исключающего необходимость проведения сложных и трудоемких процедур очистки пенициллиназы.

Культуральную жидкость без какой-либо предварительной обработки подвергают микрофильтрации на фильтре с размером пор около 0,2 мкм. С этой целью могут быть использованы трубчатые керамические фильтры в условиях тангенциальной фильтрации. Для повышения выхода продукта в конце процесса микрофильтрации нативный раствор, остающийся в концентрате, вытесняют солевым буферным раствором.

Задерживаемые фильтром фракции, содержащие промытую биомассу, после убивки отбрасывают.

В результате операции микрофильтрации происходит отделение бактериальной биомассы и первичная очистка целевого продукта от высокомолекулярных примесей, молекулярная масса которых существенно превышает молекулярную массу пенициллиназы, которая оценивается величиной 28 кДа.

Полученный фильтрат подвергают ультрафильтрации через фильтр с НОММ около 10 кДа. С этой целью могут быть использованы, например, полимерные мембраны. Прошедшие через фильтр фракции отбрасывают.

Использование фильтра с такими параметрами позволяет освободиться от значительной части низкомолекулярных соединений при малых потерях целевого продукта.

На этом этапе выделения пенициллиназы помимо удаления посторонних низкомолекулярных соединений достигают концентрирования очищенного раствора фермента.

В конце процесса ультрафильтрации концентрат пенициллиназы промывают буферным раствором, в частности фосфатным буфером, с рН 6,5-8,0. Такая процедура способствует более полному удалению низкомолекулярных примесей и замещению их на компоненты, стабилизирующие конечный продукт. Необходимость каких-либо дополнительных процедур по корректировке значений рН в процессе приготовления и использования конечного продукта не требуется.

Длительность процесса получения из культуральной жидкости водного концентрата пенициллиназы составляет примерно 8 часов.

Полученный концентрат пенициллиназы подвергают стерилизующей фильтрации, вносят для дополнительной стабилизации конечного продукта хлористый натрий и лимонно-кислый натрий и лиофильно высушивают.

Получаемый описанным методом целевой продукт имеет активность не ниже 40 тыс. ЕД/мг, а выход фермента составляет не менее 70 % от его содержания в культуральной жидкости.

Приводимые Примеры лишь иллюстрируют сущность изобретения и не могут носить ограничивающего характера.

ПРИМЕР 1. Колбы объемом 350 мл, каждая из которых заполнена 35 мл посевной среды, засевают взвесью спор культуры Bacillus licheniformis БСТ-1. Посевная среда имеет следующий состав (вес.%): гидролизат казеина по аминному азоту (0,15), натрий лимонно-кислый трехзамещенный (0,6), калий фосфорно-кислый однозамещенный (0,27), магний серно-кислый семиводный (0,04) и вода водопроводная (до 100). рН среды имеет значение 7,1. Колбы помещают на круговую качалку с числом оборотов 280-290 об/мин, и процесс культивирования осуществляют в течение 18 часов при температуре 34±0,5^oС.

Полученный посевной материал в количестве 3% используют для засева ферментационной среды того же состава. Культивирование проводят в ферментере с рабочим объемом 10 л в течение 17 часов при температуре 34±0,5^oС при скорости вращения мешалки 450-500 об/мин и при расходе воздуха на аэрацию 0,7÷1,0 об/об/мин.

После завершения этапа ферментации накопление пенициллиназы в культуральной жидкости составляло 200 тыс. ЕД/мл.

Культуральную жидкость подвергают микрофильтрации на трубчатых керамических фильтрах с размером пор около 0,2 мкм в условиях тангенциальной фильтрации при давлении 1,5 ати. Для повышения выхода продукта в конце процесса микрофильтрации нативный раствор, остающийся в концентрате, вытесняют солевым буферным раствором.

Собранный фильтрат пропускают через ультрафильтр с полимерной мембраной, обеспечивающей НОММ примерно 10 кДа, в режиме циркуляции под давлением 2 ати. Скорость ультрафильтрации составляла 20 л/м²/час. В конце процесса ультрафильтрации в концентрат пенициллиназы периодически добавляют фосфатный буфер с рН 7,0. Общий объем фосфатного буфера, направляемый на промывание ферментного концентрата, составил 8 л. В результате промывания концентрата пенициллиназы буферным раствором водная фаза была полностью заменена водно-солевой фазой, общий конечный объем которой составил 1,4 л, и значение рН концентрата при этом равнялось 7,1.

Содержание пенициллиназы в концентрате составляло 1200 тыс. ЕД/мл.

Концентрат подвергают стерилизующей фильтрации через фильтры фирмы Millipore с размером пор 0,45 мкм и вводят в концентрат стерильный раствор стабилизатора (хлористый натрий и лимонно-кислый натрий в соотношении 9:1). Суммарное количество стабилизатора в концентрате составляет 17 мг на 1 млн. ЕД пенициллиназы.

Общая длительность процедуры переработки культуральной жидкости составила 10 часов.

Стабилизированный концентрат пенициллиназы повторно стерилизуют, пропуская в стерильных условиях через стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм, а затем разливают в стерильные флаконы и лиофильно высушивают.

Удельная активность полученного препарата пенициллиназы равнялась 50 тыс. ЕД/мг.

Общий выход фермента составил 82% от суммарной активности пенициллиназы в исходной культуральной жидкости.

ПРИМЕР 2. Колбы объемом 350 мл, каждая из которых заполнена 35 мл посевной среды, засевают взвесью спор известной коллекционной культуры Bacillus licheniformis 749/С, депонированной в Коллекции культур микроорганизмов ГНЦА. Посевная среда имеет следующий состав (вес.%): гидролизат казеина по аминному азоту (0,15), натрий лимонно-кислый трехзамещенный (0,6), калий фосфорно-кислый однозамещенный (0,27), магний серно-кислый семиводный (0,04) и вода водопроводная (до 100). рН среды имеет значение 7,2. Колбы помещают на круговую качалку с числом оборотов 280-290 об/мин, и процесс культивирования осуществляют в течение 22 часов при температуре 34±0,5^oС.

Полученный посевной материал в количестве 5% используют для засева ферментационной среды того же состава. Культивирование проводят в ферментере с рабочим объемом 10 л в течение 19 часов при температуре 34±0,5^oС при скорости вращения мешалки 450-500 об/мин и при расходе воздуха на аэрацию 0,7÷1,0 об/об/мин.

После завершения этапа ферментации накопление пенициллиназы в культуральной жидкости составляло 165 тыс. ЕД/мл.

Культуральную жидкость подвергают микрофильтрации на трубчатых керамических фильтрах с размером пор около 0,2 мкм в условиях тангенциальной фильтрации при давлении 1,5 ати. Для повышения выхода продукта в конце процесса микрофильтрации нативный раствор, остающийся в концентрате, вытесняют солевым буферным раствором.

Собранный фильтрат пропускают через ультрафильтр с полимерной мембраной, обеспечивающей НОММ примерно 10 кДа, в режиме циркуляции под давлением 2 ати. Скорость ультрафильтрации составляла 20 л/м²/час. В конце процесса ультрафильтрации в концентрат пенициллиназы периодически добавляют фосфатный буфер с рН 7,0. Общий объем фосфатного буфера, направляемый на промывание ферментного концентрата, составил 12 л. В результате промывания концентрата пенициллиназы буферным раствором водная фаза была полностью заменена водно-солевой фазой, общий конечный объем которой составил 1,2 л, и значение рН концентрата при этом равнялось 7,1.

Содержание пенициллиназы в концентрате составляло 1000 тыс. ЕД/мл.

Концентрат подвергают стерилизующей фильтрации через фильтры фирмы Millipore с размером пор 0,45 мкм, и вводят в концентрат стерильный раствор стабилизатора (хлористый натрий и лимонно-кислый натрий в соотношении 9:1). Суммарное количество стабилизатора в концентрате составляет 17 мг на 1 млн. ЕД пенициллиназы.

Общая длительность процедуры переработки культуральной жидкости составила 18 часов.

Стабилизированный концентрат пенициллиназы повторно стерилизуют, пропуская в стерильных условиях через стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм, а затем разливают в стерильные флаконы и лиофильно высушивают.

Удельная активность полученного препарата пенициллиназы равнялась 40 тыс. ЕД/мг.

Общий выход фермента составил 70% от суммарной активности пенициллиназы в исходной культуральной жидкости.

Из приведенных примеров становятся очевидными преимущества настоящего предложения перед известными решениями той же задачи.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения фермента пенициллиназы, может быть использовано в медицине, аналитических целях, для определения содержания в препаратах β-лактамных антибиотиков активного начала. Штамм Bacillus licheniformis БСТ-1 выделен из Bacillus licheniformis 749/с путем ступенчатой селекции требуемыми характеристиками. Способ получения пенициллиназы предусматривает получение культуральной жидкости, микрофильтрацию культуральной жидкости на фильтре с размером пор 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного фильтрата на фильтре, задерживающая способность которого характеризуется номинальной отсекаемой молекулярной массой 10 кДа, причем в конце процесса ультрафильтрации образующийся концентрат промывают фосфатным буфером с рН 6,8-7,5. Промытый концентрат стерилизуют методом стерилизующей фильтрации и лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает стабильный выход фермента на стадии биосинтеза и упрощает выделения пенициллиназы с требуемым уровнем чистоты препарата. 2 с. и 2 з.п.ф-лы.

1. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2246D - продуцент пенициллиназы.2. Способ получения пенициллиназы, характеризующийся тем, что культуру-продуцент выращивают в оптимальных для ее развития условиях, культуральную жидкость подвергают микрофильтрации на фильтре с размером пор 0,2 мкм, полученный фильтрат подвергают ультрафильтрации на фильтре, задерживающая способность которого характеризуется номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ), равной примерно 10 кДа, причем в конце процесса ультрафильтрации образующийся концентрат целевого продукта промывают фосфатным буфером с рН 6,8-7,5, полученный промытый концентрат стерилизуют методом стерилизующей фильтрации и лиофильно высушивают.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве культуры-продуцента используют штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2246D.4. Способ по любому из п.2 или 3, отличающийся тем, что культуру-продуцент выращивают на питательной среде, включающей в качестве источников углерода и азота их легко усваиваемые формы, предпочтительно гидролизаты белкового материала.