СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОРАЖЕНИЯ ЗЕРНА МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/10 

Изобретение относится к пищевой промышленности и сельскому хозяйству в области определения вредных веществ микробиологического происхождения и может быть использовано для определения степени поражения зерна метаболитами грибов.

Наибольшую опасность для зернового хозяйства России представляет загрязнение зерна фузариотоксинами От среднегодовых объемов закупки на хлебоприемные пункты РФ поступает порядка 10% пшеницы с наличием фузариозных зерен, причем полностью непригодной для продовольственных целей оказывается из нее 2 2,5% Это не только приводит к значительным экономическим потерям, но, учитывая необратимые последствия воздействия зараженного фузариозом зернопродуктов на организм человека, создает серьезную социальную проблему. В рыночной экономике, когда контроль за условиями хранения зерна и зернопродуктов в значительной мере уходит из сферы государственных органов, эта проблема еще более обостряется. Вместе с этим возрастает потребность в простых и доступных средствах контроля, способных на практике обеспечить выполнение принятых законов и правил сертификации.

В настоящее время в России и станах СНГ установлены следующие предельно-допустимые концентрации микротоксинов:
афлатоксин В1-5 мг/кг для зерна и зернопродуктов;
комитоксин 1,0 мг/кг для сильных и твердых пшениц; 0,5 мг/кг для остальной пшеницы продовольственного назначения;
Т-2 токсин 0,1 мг/кг для зерна и зернопродуктов;
зеараленон 1,0 мг/кг для зерна и зернопродуктов.

В продуктах детского питания содержание перечисленных микротоксинов не допускается полностью.

В настоящее время большинство известных методов определения степени поражения зерна микроскопическими грибами являются длительными по времени, дорогостоящими и требующими высокой квалификации исследователей, что делает их малопригодными для системы производства, хранения и переработки зерна. По этой причине в "Правилах сертификации зерна и зернопродуктов" в качестве методов испытаний на зараженность микроскопическими грибами рекомендуется использовать лишь визуальные методы определения, основанные на чисто субъективных оценках и являющихся также трудоемкими и длительными по времени. Поэтому для реального претворения в жизнь упомянутых выше принятых правил требуется высокоточный экспресс-метод определения степени поражения зерна различными видами микроскопических грибов.

Известен способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, включающий размалывание зерна, приготовления экстракта, введении его в реакционную смесь, содержащую НАДИ:ФМН оксидоредуктазу, люциферазу и их субстраты, определении в экстракте наличия грибных метаболитов по интенсивности их свечения и суждение о степени поражения зерна по отношению интенсивностей биолюминесценции реакционной смеси в присутствии экстрактов зерна и без него (кл. G01N 33/10, авторское свидетельство СССР N 1557521, 1990).

Однако известный способ является трудоемким, требует наличия специфических дефицитных реактивов для своего существования и химиков-специалистов, а также является достаточно длительным (1 1,2 ч) при достаточно высокой ошибке измерений до 10%
Так как предельно допустимые концентрации микротоксинов составляют для различных видов микроскопических грибов всего 0,1 5 мг/кг зерна, а в продуктах детского питания их содержание вообще недопустимо полностью, то такая величина ошибки измерений является недопустимо высокой.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, включающий взвешивание выделенной пробы зерна, подготовке ее к исследованию посредством шелушения 38 42 с при зазоре между обрезиненными валками 0,3 0,5 мм, шлифования 19 32 с при зазоре между абразивными барабаном и тормозной колодкой 2,9 3,2 мм, УФ-облучение пробы, отделение выявленного зерна с зелено-желтой флуоренценцией, взвешивание его и определение степени поражения партии зерна по проценту зерен с зелено-желтой флуоренценцией в выделенной пробе зерна (кл. G01N 33/10, 21/33, авторское свидетельство СССР N 1822496, 1993 г.).

Однако известный способ является трудоемким, требует наличия специального громоздкого шелушильного и шлифовального оборудования, а также, является достаточно длительным (более 1 ч) и основан на чисто субъективных оценках, что обусловливает достаточно высокую (10 12%) ошибку измерений; а такая величина для зернопродуктов, особенно для продуктов детского питания, как отмечалось выше, часто является недопустимо высокой.

Достигаемым новым техническим результатом изобретения является повышение точности определения при сокращении длительности.

Новый технический результат достигается тем, что в способе определения поражения зерна микроскопическими грибами, включающем выделение исследуемой пробы зерна с микроскопическими грибами и контрольной пробы с известным содержанием здорового зерна, подготовку проб к исследованию, облучение, регистрацию физического параметра проб и суждение о степени поражения зерна, в отличие от прототипа, при подготовке проб к исследованию осуществляют их размалывание и таблетирование, обучение осуществляют на длине волны 360 500 нм, а в качестве физического параметра используют разность биоэлектрических потенциалов, после регистрации биоэлектрических потенциалов таблеток их разность усиливают, преобразовывают в амплитудно-частотную характеристику плотности спектральной мощности биотока, отфильтровывают высокочастотные свыше сопрягающей частоты области фликер шума, например свыше 2000 Гц составляющие амплитудно-частотной характеристики, раскладывают последнюю в интервале 0 - 2000 Гц в области фликер шума, определяют зависимость параметров амплитудно-частотной характеристики от времени, расшифровывают ее посредством построения спектрограммы фликер шума, описываемой следующим выражением:

где S(W) амплитудно-частотная характеристика в виде плотности спектральной мощности биотока таблетки в области фликер шума;
W частота;
скорость изменения массы-энергии пространственно-временных диссипативных структур таблетки, формирующих субпространства структуры биотока таблетки при изменении частоты в пределах интервала ΔW;;
ΔW интервал частот, показывающий область устойчивости пространственно-временных диссипативных структур таблетки, формирующих субпространства структуры биотока определенной степени изотропности и определяемый из следующего выражения:
ΔW = Wnкр

- Wn-1кр,
где Wnкр и Wn-1кр - критические частоты, определяемые пересечением последовательных параллельных прямых, образуемых совокупностью максимального количества точек, включающих минимальные значения точек S(W_i)_min, принадлежащих каждому из интервалов
ΔW^n-(n-1), ΔW^(n-1)-(n-2),...,
и осуществляют построение из спектрограммы относительного изменения массы-энергии пространственно-временных диссипативных структур от времени

а о степени поражения зерна судят по степени смещения по крайней мере двух частот W_i и W_j на наиболее длинных интервалах ΔW, на которых относительное изменение соответствующей скорости массы энергии пространственно-временных диссипативных структур от времени,

на частотах W_i и W_j происходит в противофазе, относительно аналогичных частот для контрольной пробы с известным содержанием здорового зерна.

Регистрация разности биоэлектрических потенциалов может быть осуществлена при подаче на два дополнительно установленных на таблетке крайних, относительно двух съемных, электрода постоянного тока от внешнего источника энергии.

Фиг. 1 5 поясняют предлагаемый способ.

Амплитудно-частотная характеристика плотности спектральной мощности биотока и параметры пространственно-временных диссипативных структур могут быть детерминированы по времени в течение суток фиксированием с интервалом в 600±1 c на основе линейного усреднения 128 спектров амплитудно-частотной характеристики плотности спектральной мощности биотока для каждого из интервалов шириной не более 12,5 Гц, полученных в реальном масштабе времени. Таблетка может быть установлена при температуре жидкого азота и экранирована от влияния электромагнитных полей.

Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами реализуют следующим образом.

Основная часть исследованных проб представляла собой пшеницу IV типа - озимую краснозерную высокостекловидную пшеницу из районов Северного Кавказа, возделываемую в очагах возникновения фузариоза колоса.

Для установления зависимости доза-эффект были составлены модельные смеси, в которых содержание фузариозных зерен колебалось в пределах от 0,5 до 50% В качестве контрольной использовали также 100% пробу нормального здорового зерна и 100% пробу фузариозного зерна. Модельные смеси представлены в таблице. Готовили также исследуемую пробу с неизвестной степенью поражения микроскопическими грибами.

Подготовку проб к исследованию осуществляли измельчением зерна в лабораторной мельнице ЛЗМ до 250 мкм в течение 3 мин. Однородность модельных смесей обеспечивалась многократным перемешиванием и просеиванием смешиваемых компонентов.

Для характеристики анализируемых проб пшеницы использовали два основных показателя:
содержание фузариозных зерен;
содержание микотоксинов, т. е. дезоксиниваленола (ДОН) и зеараленола (3Н).

Определение содержания фузариозных зерен проводили в соответствии с "Методическими указаниями по учету фузариоза колоса и визуальному определению фузариоза зерна пшеницы" (утв. Минздравом СССР, Госагропром СССР и Минхлебопродуктов СССР 15.07.87 г.).

Затем пробы таблетировали посредством помещения размельченного зерна в матрицу прессовочной машины под давлением 250 кг/см² и размером 10х5х2 мм.

На поверхность таблетки устанавливают 4 электрода. Токопроводность омических контактов обеспечивали кремнеорганической пастой.

Таблетку с электродами помещают в оптически прозрачную кювету, снабженную системой термоконтроля и помещают в экранированную камеру с оптически прозрачным окном. Образец охлаждают до температуры жидкого азота и облучают импульсной ксеноновой лампой типа ИФК-120 с частотой 5 Гц, длительностью импульса 30 мкс при электрической энергии вспышки ≈ 0,1 Дж. Для выделения возбуждающего люминесценцию излучения с длиной волны 350 500 нм использовали соответственно подобранные светофильтры СС-4 и СЗС-22.

Суть изобретения в фиксировании энергии, представляющей собой разность энергии возбуждения (360 500 нм) и энергии люминесценции (520 700 нм) при помощи спектрального анализа части этой энергии, приходящийся на область низких частот.

Перед облучением через два крайних электрода пропускают постоянный электрический ток силой 0,6 мА от внешнего источника тока, а через два средних электрода измеряют разность биоэлектрических потенциалов.

Снятую разность биоэлектрических потенциалов подают на предусилитель ПУ-2 с уровнем собственного шума 1-2ДБ для усиления сигнала в 200 раз. Преобразовывают разность биоэлектрических потенциалов в амплитудно-частотную характеристику (АЧХ) плотности спектральной мощности биотока, отфильтровывают высокочастотные свыше 2000 Гц составляющие АЧХ и раскладывают последнюю в интервале 0 2000 Гц в области фликер шума с помощью узкополосного частотного анализатора спектра БК 2031 фирмы "Брюль и Кьер" (Дания), подключенного к выходу предусилителя ПУ-2.

Затем определяют зависимость параметров АЧХ от времени. При этом анализатор работает в реальном масштабе времени, проводя линейное усреднение из 128 значений, получаемой от пробы в виде таблетки информации спектров АЧХ в каждой из узких частотных интервалов (12,5 Гц) спектра от 0 до 2000 Гц в области фликер-шума за 2.10^-2 c. Автоматически расшифровывают АЧХ исследуемых процессов в структуре биотока от времени в децибеллах (ДБ) посредством построения спектрограммы фликер-шума (фиг.1), описываемой следующим выражением:

где S(W) АЧХ в виде плотности спектральной мощности биотока таблетки в области фликер-шума,
W частота;
скорость изменения массы-энергии пространственно-диссипативных структур биотока пробы в виде таблетки при изменении частоты в пределах интервала ΔW;
ΔW интервал частот, показывающий область устойчивости пространственно-временных диссипативных структур пробы в виде таблетки, формирующих субпространства структуры биотока определенной степени изотропности и определяемый из следующего выражения:
ΔW = Wnкр

- Wn-1кр,
где Wnкр и Wn-1кр критические частоты, определяемые пересечением последовательных параллельных прямых 1,2,3. и 1', 2', 3',образуемых совокупностью максимального количества точек, включающих значения точек S(W_i)_min, принадлежащих каждому из последовательных интервалов .

При этом величину для каждого интервала и т. д. определяют как семейства параллельных прямых, принадлежащих соответствующему интервалу.

После чего определяют зависимость от времени (фиг.3,4,5) относительного изменения массы-энергии пространственно-временных диссипативных структур от времени, для оценки скорости .

Причем величины ΔS(W_i) и ΔS(W_j) относительное длительное изменение спектральной плотности мощности шума биотока по частотам W_i, W_j, характеризующие условия стационарного состояния биообъекта (пробы в виде таблетки), определят как представлено на фиг.3.

Верифицируемость получаемых предложенным способом данных о физиологических параметрах пробы зерна в виде таблетки достигается благодаря жесткому фиксированию времени суток (±1c ) проведения измерений, фиксирования в пространстве положения исследуемой пробы в виде таблетки и измерительных электродов, а также точности поддержания температуры (±0,5^oC), от которых зависит физиологическое состояние пробы, сила биоэлектрического тока и параметры его структуры. Жесткая "привязка" ко времени обусловлена зависимостью процессов самоорганизации от времени и тем, что для неэргодических систем, к которым относятся любые биообъекты, среднее по состояниям не эквивалентно среднему по времени. По этой причине сравнивать зависимость параметров макроструктуры таблетки, возникающей в результате процессов самоорганизации, от состава можно только при условии жесткого фиксирования времени начала эксперимента.

Статистический анализ для неэргодических систем возникает только по отношению к когерентному времени суток.

Относительная ошибка в определении величин для соответствующих интервалов частот для максимальной величины силы биотока контрольной и исследуемой проб составляет 1%
Относительная ошибка определения частот W_i, W_j, W_k и т.д. связанных с существованием пространственно-временных диссипативных структур, между которыми происходит перераспределение энергии ΔS(W_i), ΔS(W_j), ΔS(W_k),..., от времени, составляет 3%
Определив, как описано выше, для таблетки пробы зерна с микроскопическими грибами и таблетки контрольной пробы здорового зерна величины для каждого из интервалов и величины этих интервалов, частоты W_i, W_j, W_k, на которых фиксируется изменение во времени значений S(W_i), S(W_j), S(W_k), а также относительного изменения величин ΔS(W_i), ΔS(W_j), ΔS(W_k),...,, строят графическую зависимость этих величин от времени, соблюдая условия верифицируемости данных о неэргодичных системах, проводят сравнительный анализ полученных результатов, выбирая для анализа по крайней мере две частоты W_i, W_j, наиболее длительных интервалах ΔW, на которых относительное изменение соответствующей скорости массы-энергии пространственно-временных диссипативных структур от времени на частотах W_i и W_j происходит в противофазе.

Стационарность процесса поглощения энергии света молекулярной структурой грибка и ее перераспределения между теплотой и работой люминесценции проявляются в появлении новых значений частот и т.д.

Эти частоты сравнивают с эталонными частотами таблетированной муки, приготовленной из зерна с известной степенью зараженности фузариозом, определяемой в например, по отношению к 100 зернам и, таким образом, определяют степень зараженности. Чувствительность предлагаемого метода велика.

На это указывает простой расчет. Точность фиксирования S(W) 0,1 ДБ.

0,1ДБ 10^-9 B 10^-8 Вт/А: при 6.10^-4 A, фиксируемая мощность составляет 10^-13 Вт.

На область фликер шума приходится 0,5.10^-13 Вт, а на одну из 400 полос диапазона исследуемого спектра приходится 5/400.10^-14 или 10^-16 Вт 10^-16 Дж/с.

Энергия поглощения на длине волны λ 400 нм составляет 4,2.10^-9 дис.

При облучении ксеноновой лампой, работающей с частотой световых импульсов 1 10 Гц, при частоте 5 Гц и электрической энергии вспышки ≈ 0,1 Дж, длительности импульса ≈ 30 мкс на исследуемом объекте плотности мощности ≈ К.10 Вт/см², плотность энергии ≈ К 0,3 мДж/см² (К коэффициент пропускания светофильтра; К≅1).

Чувствительность метода, оцененная по фиксированной мощности, на 7 порядков превышает величину энергии поглощаемой при фотовозбуждении.

Благодаря этому представляется возможным фиксировать степень зараженности фузариозом на уровне 1% (рис.5).

В то время как в способе по прототипу ошибка измерений составляет не менее 10% Длительность определения степени поражения зерна предлагаемым способом при известном расположении частот W_i, W_j и т.д. для соответствующих контрольных проб с известным количеством здорового зерна, проводимое один раз для последующей оценки проб с неизвестной степенью зараженности микроскопическими пробами, не превышает 5 мин, что не менее чем на порядок меньше по длительности, чем по прототипу.

Границы длин волн облучения 360 500 нм обусловлены тем, что при длинах волн облучаемого спектра излучения ниже 360 нм возникает полоса люминесценции менее 500 нм (преимущественно при 420 430 нм), при которых присутствие фузариоза относительно слабо влияет на изменение интенсивности спектра зерна. При длине волны облучаемого спектра свыше 500 нм возникает полоса люминесценции свыше 700 нм, при которой также присутствие фузариоза относительно слабо влияет на изменение интенсивности спектра зерна.

На основании вышеизложенного новым достигаемым техническим результатом изобретения является:
1. Повышение точности определения степени поражения зерна не менее чем на порядок.

2. Сокращение длительности определения степени поражения зерна не менее чем на порядок.

3. Упрощение технологии определения степени пораженности зерна за счет отказа от использования громоздкого шлифовального оборудования.

В настоящее время на предприятии ГП "НПО Астрофизика" проведены испытания заявляемого способа определения поражения зерна микроскопическими грибами и выпущена технологическая инструкция реализации способа.

Назначение: изобретение относится к области пищевой промышленности и сельского хозяйства и может быть использовано для определения поражения зерна метаболитами грибов. Сущность изобретения: формирование исследуемой пробы зерна и контрольной пробы с известным содержанием здорового зерна, размалывание и таблетирование проб, облучение их в диапазоне длины волн 360 - 500 нм, измерение разности биоэлектрических потенциалов и вынесение суждения о степени зараженности исследуемой пробы зерна метаболитами грибов. 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

1. Способ определения поражения зерна микроскопическими грибами, включающий выделение исследуемой пробы зерна с микроскопическими грибами и контрольной пробы с известным содержанием здорового зерна, подготовку проб к исследованию, облучение, регистрацию физического параметра проб и суждение о степени поражения зерна, отличающийся тем, что при подготовке проб к исследованию осуществляют размалывание зерна исследуемой и контрольной партии и таблетирование муки, облучение таблеток осуществляют оптическим излучением с длиной волны 360 500 нм, а регистрацию физического параметра проб осуществляют посредством измерения биоэлектрических потенциалов таблеток, причем о степени поражения зерна судят путем сравнения измеренных величин. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерение разности биоэлектрических потенциалов таблеток осуществляют при подаче на два дополнительно установленных на таблетке крайних относительно двух съемных электрода постоянного тока от внешнего источника энергии. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что перед облучением таблетку размещают при температуре жидкого азота и экранируют от влияния электромагнитных полей. 4. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что после измерения разности биоэлектрических потенциалов таблеток их усиливают, преобразовывают в амплитудно-частотную характеристику плотности спектральной мощности биотока, отфильтровывают высокочастотные свыше 2000 Гц составляющие амплитудно-частотной характеристики, раскладывают последнюю в интервале 0 - 2000 Гц в области фликер шума, определяют зависимость параметров амплитудно-частотной характеристики от времени, расшифровывают ее посредством построения спектрограммы фликер шума, описываемой следующим выражением:

где S(W) амплитудно-частотная характеристика в виде плотности спектральной мощности биотока таблетки в области фликер шума;
W частота;
скорость изменения массы-энергии пространственно-временных диссипативных структур биотока таблетки при изменении частоты в пределах интервала ΔW;
ΔW интервал частот, показывающий область устойчивости пространственно-временных диссипативных структур таблетки, формирующих субпространства структуры биотока определенной степени изотропности и определяемый из следующего выражения ΔW = Wnкр

- Wn-1кр,
где Wnкр и Wn-1кр - критические частоты, определяемые пересечением последовательных параллельных прямых, образуемых совокупностью максимального количества точек, включающих минимальные значения точек S(W_i)_m i n, принадлежащих каждому из интервалов ΔW^n-(n-1), ΔW^(n-1)-(n-2), ..., и осуществляют построение из спектрограммы скорости относительного изменения массы-энергии пространственно-временных диссипативных структур от времени а о степени поражения зерна судят по степени смещения по крайней мере двух частот W_i и W_j на наиболее длительных по времени интервалах ΔW, на которых относительное изменение соответствующей скорости массы-энергии пространственно-временных диссипативных структур от времени на частотах W_i и W_j происходит в противофазе относительно аналогичных частот для контрольной таблетки с известным содержанием здорового зерна.