СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ПОРАЖЕНИЯ ЗЕРНА МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПРОБ ЗЕРНА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/10 G01N21/64 

Изобретение относится к пищевой промышленности и сельскому хозяйству в области определения вредных веществ микробиологического происхождения и может быть использовано для определения степени поражения зерна метаболитами грибов.

Наибольшую опасность для зернового хозяйства России представляет загрязнение зерна фузариотоксинами. От среднегодовых объемов закупки на хлебоприемные предприятия РФ поступает порядка 10% пшеницы с наличием фузариозных зерен, причем полностью непригодной для продовольственных целей оказывается из нее 2 2,5% Это не только приводит к значительным экономическим потерям, но, учитывая необратимые последствия воздействия зараженных фузариозом зернопродуктов на организм человека, создает серьезную социальную проблему. В рыночной экономике, когда контроль за условиями хранения зерна и зернопродуктов в значительной мере уходит из сферы государственных органов, эта проблема еще более обостряется. Вместе с этим возрастает потребность в простых и доступных средствах контроля, способных на практике обеспечить выполнение Законов и Правил сертификации.

В России и странах СНГ установлены следующие предельно-допустимые концентрации микотоксинов:
афлатоксин В1 5 мг/кг зерна и зернопродуктов;
вомитоксин 1,0 мг/кг для сильных и твердых пшениц;
0,5 мг/кг для остальной пшеницы предварительного назначения;
Т-2 токсин 0,1 мг/кг для зерна и зернопродуктов;
зеараленон 1,0 мг/кг для зерна и зернопродуктов.

В продуктах детского питания содержание перечисленных микотоксинов не допускается полностью.

В настоящее время большинство известных методов определения степени поражения зерна микроскопическими грибами являются длительными по времени, дорогостоящими и требующими высокой квалификации исследователей, что делает из малопригодными для системы производства, хранения и переработки зерна. По этой причине в "Правилах сертификации зерна и хлебопродуктов" в качестве испытаний на зараженность микроскопическими грибами рекомендуется использовать визуальные методы определения, основанные на чисто субъективных оценках и являющихся также трудоемкими и длительными по времени.

Визуальные методы не позволяют надежно отличить зерно, зараженное фузариями, от зерна, изменившего свой цвет из-за погодных условий. Поэтому возможна отбраковка зерна, не содержащего микотоксинов и поэтому безопасное.

В рыночной экономике, когда контроль за условиями хранения зерна и зернопродуктов уходит из сферы государственных органов, эта проблема еще более обостряется. Вместе с этим возрастает потребность в простых и доступных средствах контроля, способных на практике обеспечить выполнение закона о защите прав потребителей и Закона о сертификации продукции, в частности "Правила сертификации зерна и продуктов его переработки".

Наиболее близким техническим решением является способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, включающий размалывание зерна, приготовление экстракта, введение его в реакционную смесь, содержащую НАДН: ФМН оксидоредуктазу, люциферазу и их субстраты, определении в экстракте наличие грибных метаболитов по интенсивности их свечения и суждение о степени поражения зерна по отношению интенсивностей биолюминесценции реакционной смеси в присутствии экстрактов зерна и без него. (1)
Однако известный способ является трудоемким, требует наличия специфических дефицитных реактивов для своего осуществления и химиков-специалистов высокой квалификации, а также является достаточно длительным (не менее 1 ч) по времени при достаточно высокой ошибке измерений до 10% Так как допустимые концентрации микотоксинов составляют для различных видов микроскопических грибов всего 0,1 5 мг/кг зерна и в продуктах детского питания их содержание вообще недопустимо, то такая степень ошибки измерений является недопустимо высокой.

Наиболее близким решением является также устройство для измерения биолюминисценции проб зерна, содержащее источник излучения, светофильтры, выделяющие возбуждающее биолюминесценцию излучение и спектральную полосу биолюминесценции, держатель для проб, фотоприемник, оптическую систему формирования пятна биолюминесцентного излучения для фотоприемника и регистрирующий узел.(2)
Однако известное устройство обладает низкой разрешающей способностью и не позволяет определять степень поражения зерна микроскопическими грибами ниже 10%
Техническим результатом изобретения является повышение разрешающей способности и точности определения степени поражения зерна микроскопическими грибами при сокращении длительности процесса измерения.

Технический результат достигается тем, что в способе определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, включающем размалывание зерна с микроскопическими грибами, определение наличия микроскопических грибов по сравнению интенсивностей биолюминесценции пробы размолотого зерна и контрольной пробы, в качестве контрольной пробы используют размолотое зерно без грибов, биолюминесценцию проб зерна инициируют посредством их получения в диапазоне длин волн 360 500 нм, а наличие микроскопических грибов по интенсивности их биолюминесценции регистрируют в диапазоне длин волн 520 700 нм.

Биолюминесценцию проб зерна инициируют посредством их частотно-импульсного облучения.

При степени поражения зерна микроскопическими грибами менее 5 мас. регистрацию наличия микроскопических грибов по интенсивности их биолюминесценции осуществляют при каждом из 20 1000 импульсов в диапазоне длин волн 530 650 нм и судят о степени поражения зерна микроскопическими грибами по среднестатистическому отношению (см. далее),где I_ср - степень поражения зерна микроскопическими грибами; "дельта" измеренная при каждом импульсе интенсивность биолюминесценции пробы размолотого зерна с микроскопическими грибами; I_ср среднее значение интенсивности биолюминесценции размолотого зерна без грибов.

Частотно-импульсное облучение осуществляют с суммарной плотностью энергии 0,1 1,5 Дж/см² при частоте 1 1000 Гц.

Технический результат достигается также тем, что устройство для измерения биолюминесценции проб зерна, содержащее источник излучения, светофильтры, выделяющие возбуждение биолюминесценцию излучение и спектральную полосу биолюминесценции, держатель для пробы, фотоприемник, оптическую систему формирования пятна биолюминесцентного излучения для фотоприемника и регистрирующий узел, снабжено накопителем сравнительной информации об интенсивностях биолюминесценции проб зерна и контрольной пробы, установленным между фотоприемником и регистрирующим узлом, а держатель для пробы выполнен в виде кюветы, вход которой оптически сопряжен через светофильтры, выделяющие возбуждающее биолюминесценцию излучения, а выход с фотоприемником через последовательно установленные светофильтры, выделяющие спектральную полосу биолюминесценции, и оптическую систему формирования пятна, которая установлена на входе фотоприемника.

На чертеже представлена принципиальная схема предлагаемого устройства.

Устройство содержит накопитель 2 сравнительной информации об интенсивностях биолюминесценции пробы зерна 1 и контрольной пробы, установленной между фотоприемником 3 и регистрирующим узлом 4, кювету 5, вход 6 которой оптически сопряжен через светофильтры 7, выделяющие возбуждающее биолюминесценцию излучение, с источником излучения 8, а выход 9 с фотоприеником 3 через последовательно установленные светофильтры 10, выделяющие спектральную полосу биолюминесценции, и оптическую систему 11 формирования пятна, которая установлена на входе фотоприеника 3.

Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами реализуют следующим образом.

Основная часть исследованных проб представляла собой пшеницу IV типа - озимую краснозерную высокостекловидную пшеницу из районов Северного Кавказа, возделываемую в очагах возникновения фузариоза колоса.

Для установления зависимости доза-эффект были составлены модельные смеси, в которых содержание фузариозных зерен колебалось в пределах 0,5 50% В качестве контрольной использовали также 100%-ную пробу нормального здорового зерна и 100% -ную пробу фузариозного зерна. Модельные смеси представлены в табл. 1. Готовили также исследуемую пробу с неизвестной степенью поражения микроскопическими грибами. Подготовку проб к исследованию осуществляли измельчением зерна в лабораторной мельнице ЛЗМ до 250 мк в течение 3 мин. Однородность модельных смесей обеспечивалась многократным перемешиванием и просеиванием смешиваемых компонентов.

Для характеристики анализируемых проб пшеницы использовали два основных показателя
содержание фузариозных зерен;
содержание микотоксинов, т.е. дезоксиниваленола (ДСН) и зеараленола (ЗН).

Определение содержания модельных смесей с фузариозным зерном проводили в соответствии с "Методическими указаниями по учету фузариоза колоса и визуальному определению фузариозного зерна пшеницы" (утв. Минздравом СССР, Госагропромом СССР и Минхлебопродуктов СССР 15.07.87 г.).

Исследуемую пробу 1 (источник биолюминесцентного излучения) с неизвестной степенью поражения микроскопическими грибами помещали в кювету 5 и облучали с помощью непрерывной ртутной лампы ПРК-2 через светофильтры 7, выделяющие возбуждающее биолюминесцентное излучение, например СС-4 и СЗС-22, в диапазоне длин волн 360 500 нм, которое и облучало исследуемую пробу 1 через вход 6 кюветы 5. Монохроматор ДМР-2, представляющий собой, например, светофильтры 10, выделяющие спектральную полосу биолюминесценции, и оптическую систему 11 формирования пятна, позволяя просматривать спектр люминесценции, исходящий от исследуемой пробы 1 через выход 9 кювет 5, в диапазоне длине волн 520 700 нм.

Световой сигнал от монохроматора регистрировался фотоприемником 3 биолюминесцентного излучения и на экране регистрирующего узла 4 фиксировалась его временная развертка. При этом пиковая интенсивность осциллограммы явилась искомой характеристикой интенсивности люминесценции на данной длине волны.

В области концентрации зерна, пораженного микроскопическими грибами, менее 5 мас. определение наличия грибных метаболитов осуществляли посредством импульсно-частотного облучения исследуемой пробы зерна 1. В качестве источника излучения 8 использовали, например:
1) YAG-лазер, излучавший на длине волны 532 нм с пиковой мощностью до 1 МБт при длительности импульсов 20 нс и частоте их следования 5 Гц. В пятне облучения препарата плотность мощности достигала ≈ Ф 2 МВт/см², плотность энергии ≈ 50 мДж/см², где Ф - пропускание светофильтра (Ф<1);
2) Лампа вспышка ФЭ-27, использовавшаяся при повышенной частоте срабатывания (5 Гц) при электрической энергии вспышке ≈ 0,1 Дж, длительности импульса ≈30 мкс. На объекте плотность мощности ≈ 10 Вт/см², плотность энергии ≈ 0,3 мДж/см². Для выделения возбуждающего люминесценцию света использовались соответственно подобранные светофильтры.

Система выделения и регистрации спектра люминесценции включала приемный объектив, собирающий излучение люминесценции, фильтр для подавления отраженного излучения возбуждения, полихроматор, электронно-оптический усилитель яркости получаемого спектра и приемник излучения в виде ПЗС-линейки из 512 пар светочувствительных элементов. В качестве возможных вариантов фотоприемника 3 может использоваться либо ФЭУ, например ФЭУ-51, либо фоторезистивный элемент, включающие источник питания.

Фотоприемник при этом должен удовлетворять двум требованиям:
его рабочая область должна совмещаться с полосой люминесценции, выделенной светофильтром;
чувствительность приемника должна обеспечивать регистрацию биолюминесцентного излучения, а интенсивность выходного электрического сигнала должна примерно линейным образом зависеть от интенсивности входного светового сигнала и согласовываться с последующей каскадной схемой прибора.

Для обработки сигналов фотоприемника 3 и выдачи информации на регистрирующий узел 4 в качестве накопителя 2 сравнительной информации об интенсивностях биолюминесценции пробы зерна и контрольной пробы использовали миниЭВМ.

Зафиксированный в каждом отдельном импульсе облучения спектр считывался с ПЗС-линейки в управляющую миниЭВМ и представлялся в графическом виде на мониторе. Спектры регистрировались в импульсно-периодическом режиме с частотой 5 Гц и возможностью накопления информации в цифровом виде.

Для этой цели в миниЭВМ вводили специальную программу, обеспечивающую ее работу в режиме накопления информации, поступающей при регистрации спектров биолюминесценции исследуемой и контрольной проб, в импульсно-периодическом режиме.

В качестве регистрирующего узла использовали стрелочный или цифровой индикатор, например осциллограф С-9.

Работа комплекса в целом, в частности синхронизация работы всех элементов, анализ поступающей цифровой информации о спектре, а также управление режимом работы контролировалось с пульта ПЭВМ. При этом определение наличия грибных метаболитов осуществляли при каждом импульсе в области длин волн 530 650 нм и количестве импульсов, равном 20 1000. А анализ поступающей цифровой информации о спектре заключается в статистической обработке накопленных по всем импульсам отклонений интенсивности биолюминесценции в пораженных пробах от контрольных в соответствии со следующим выражением:

где ΔI/ I_ср степень поражения зерна микроскопическими грибами;
I_им измеренная при каждом импульсе интенсивность биолюминесценции пробы размолотого зерна с микроскопическими грибами;
I_ср. среднее значение интенсивности биолюминесценции контрольной пробы размолотого зерна без микроскопических грибов.

И по среднестатистическому отношению (ΔI /I_ср.) ср.ст. превышения I_им над I_ср. судят о степени поражения зерна микроскопическими грибами. Частотно-импульсное воздействие на исследуемую пробу зерна осуществляют с суммарной плотностью энергии облучения 0,1 1,5 Дж/см² при частоте 1 1000 Гц.

Примечание: *) Не вызывает биолюминесценцию грибов.

**) Не определяется степень поражения грибами.

Как показали результаты, представленные в таблице, при длине волны облучающего излучения ниже 360 нм и выше 500 нм (примеры 1 и 7) не вызывается биолюминесценция микроскопических грибов, поразивших зернопродукты, в области длин волн 520 нм и больше. Оптимальным является облучающее излучение с длиной волны 400 500 нм. При длине волны биолюминесценции микроскопических грибов меньше 520 нм и свыше 700 нм (примеры 8 и 14) невозможно определять степень поражения зернопродуктов грибами из-за слабого различия между интенсивностью биолюминесценции микроскопических грибов и фоновой люминесценцией на этих длинах волн. Оптимальной для определения степени поражения микроскопическими грибами менее 5 мас. является интенсивность биолюминесценции на длинах волн 530 650 нм.

Количество импульсов от 20 до 1000 (примеры 16 20) необходимо для получения достаточно точного результата проведенных измерений. Так, для определения содержания зерна, пораженного микроскопическими грибами менее 5 мас. количество импульсов менее 20 (пример 15) недостаточно. А для обеспечения вероятности результата не хуже 0,9 согласно расчетным оценкам достаточно 700 1000 импульсов и дальнейшее возрастание числа импульсов (пример 21) нецелесообразно, так как приводит к перерасходу энергии и более быстрому выходу лампы из строя без обеспечения сколько-нибудь значительного повышения точности.

Выбор пределов суммарной плотности энергии облучения 0,1 1,5 Дж/см² (примеры 23-27) обусловлен тем, что при суммарной плотности энергии облучения ниже 0,1 Дж/см² (пример 22) возбуждается биолюминесценция очень слабой интенсивности, не позволяющая эффективно определять степень поражения зерна микроскопическими грибами. При суммарной плотности энергии облучения свыше 1,5 Дж/см² (пример 28) падает эффективность ее преобразования в биолюминесцентное свечение, происходит ускоренная "усталость" исследуемого зерна, при которой интенсивность биолюминесценции зараженного зерна снижается до уровня биолюминесценции зерна, не зараженного грибами.

Частота импульсов (вспышек лампы) от 1 до 1000 Гц (примеры 29-33) определяется число техническими возможностями обеспечения работы импульсного источника для каждого типа газоразрядной лампы существует свой верхний предел по частоте, а также возможностью проведения за каждый импульс необходимой обработки измерений, что определяется быстродействием используемых измерительных и анализирующих устройств. Все вышеизложенное также ограничивает частоту в пределах до 1000 Гц.

В результате проведенных испытаний показано, что предложенным способом при использовании частотно-импульсного источника возбуждения биолюминесценции возможно определение степени поражения зернопродуктов микроскопическими грибами со степенью поражения до 1% что на порядок выше, чем в способе по прототипу (пример 34) при времени определения, не превышающего 2 5 мин, что не менее чем на порядок выше, чем по прототипу (пример 34). Эти показатели достигнуты благодаря оптимизации выделения длины волны облучающего излучения и биолюминесценции, числа импульсов, плотности энергии облучения и частоты импульсов.

Достигаемым техническим результатом изобретения является
повышение точности определения степени поражения зерна микроскопическими грибами не менее чем на порядок до 1 мас.

создание экспресс-метода определения степени поражения зернопродуктов микроскопическими грибами в полевых условиях за счет сокращения длительности определения зараженности не менее чем на порядок до 2 5 мин;
создание прибора для реализации экспресс-метода, обеспечивающего возможность его использования при приемке зернопродуктов в полевых условиях в любом пункте зерноприема любому приемщику-неспециалисту;
контроль годности продуктов детского питания;
упрощение метода подготовки проб зерна продуктов к исследованию;
обеспечение контроля степени поражения зерна, в том числе микотоксинами, являющимися токсичными, а не только микроскопическими грибами, что позволяет снизить процент отбракованного зерна.

Использование: определение степени поражения зерна микроскопическими грибами. Сущность изобретения: в качестве контрольной пробы используют размолотое зерно без грибов. Биолюминесценцию проб зерна инициируют посредством их облучения в диапазоне длин волн 360...500 нм, наличие микроскопических грибов по интенсивности их биолюминесценции регистрируют в диапазоне длин волн 520...700 нм. Устройство для измерения биолюминесценции проб зерна снабжено накопителем сравнительной информации об интенсивностях биолюминесценции пробы зерна и контрольной пробы. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, включающий размалывание зерна с микроскопическими грибами, определения наличия микроскопических грибов по сравнению интенсивностей биолюминесценции пробы размолотого зерна и контрольной пробы, отличающийся тем, что в качестве контрольной пробы используют размолотое зерно без грибов, биолюминисценцию проб зерна инициируют посредством их облучения в диапазоне длин волн 360 500 нм, а наличие микроскопических грибов по интенсивности их биолюминесценции регистрируют в диапазоне длин волн 520 700 нм. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биолюминесценцию проб зерна инициируют посредством их частотно-импульсного облучения. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что при степени поражения зерна микроскопическими грибами менее 5 мас. регистрацию наличия микроскопических грибов по интенсивности их биолюминесценции осуществляют при каждом из 20 - 1000 импульсов в диапазоне длин волн 530 650 нм и судят о степени поражения зерна микроскопическими грибами по среднестатическому отношению

где степень поражения зерна микроскопическими грибами;
I_им измеренная при каждом импульсе интенсивность биолюминесценции пробы размолотого зерна с микроскопическими грибами;
I_ср среднее значение интенсивности биолюминесценции размолотого зерна без грибов. 4. Способ по п. 2 или 3, отличающийся тем, что частотно-импульсное облучение осуществляют с суммарной плотностью энергии 0,1 1,5 Дж/см² при частоте 1 1000 Гц. 5. Устройство для измерения биолюминесценции проб зерна, содержащее источник излучения, светофильтры, выделяющие возбуждающее биолюминесценцию излучение и спектральную полосу биолюминесценции, держатель для пробы зерна, фотоприемник, оптическую систему формирований пятна биолюминесцентного изучения для фотоприемника и регистрирующий узел, отличающееся тем, что оно снабжено накопителем, сравнительной информации об интенсивностях биолюминесценции пробы зерна и контрольной пробы, установленным между фотоприемником и регистрирующим узлом, а держатель для пробы зерна выполнен в виде кюветы, вход которой оптически сопряжен через светофильтры, выделяющие возбуждающие биолюминесценцию излучение, с источником излучения, а выход с фотоприемником через последовательно установленные светофильтры, выделяющие спектральную полосу биолюминесценции, и оптическую систему формирования пятна, которая установлена на входе фотоприемника.