Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами Советский патент 1990 года по МПК G01N33/10 

Изобретение относится к исследованию материалов химическими способами и может быть использовано для определения степени загрязнения зерна метаболитами грибов.

Целью изобретения является повышение точности определения и упро01ение способа.

На чертеже представлена зависимость интенсивности свечения от времени реакции.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают водный экстракт зерна и добавляют его в реакционную смесь, содержащую НАДН:ФМН-оксидоре- дуктазу, люциферазу и их субстраты, наличие метоболитов в экстракте определяют по интенсивности свечения.

Для анализа используют бифер- ментную систему НАДН:ФМН-оксидоредук- таза-люцифераза. Эти ферменты катализируют цепь двух сопряженных реакций:

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения степени поражения пищевых продуктов метаболитами грибов. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа определения степени поражения зерна микроскопическими грибами. Для этого предлагается после размалывания зерна проводить определение степени поражения зерна путем приготовления водных экстрактов зерна и добавления их в реакционную смесь, содержащую НАДН ФМН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстраты и измерения интенсивности свечения, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивности биолюминесценции экстракта зерна к интенсивности биолюминесценции реакционной смеси. 6 табл. 1 ил.

ФМН+НАДН - aHi MH 2 iЈHaoEeeZЈlSЈ2 ФМНнг НАД

Полученный в этой реакции ФМНН2 используется в реакции, катализируе- мой люцифераэой:

ФИНН

,+ RCOH + 02 22Н2 ЈЕЈЈ2 ФМН + RCQOH + Н20 + свет,

где ФМН,ФМНН - окисленная и восстановленная формы фла- винмононуклеотида;

НАД ,НАДН - окисленная и восста- новленная формы тинамиддинуклеотида; RCOH - длинноцепочечный алифатический альдегид;

&СООН - соответствующая жир-

ная кислота.

Особенностью этой системы является то, что одним из продуктов реакции является светоизлучение в сине-зеленой области спектра (длина волн 520- 600 нм).

Экстракты зерна не флуоресцируют. Зерно размалывают, проводят водную экстракцию, затем из экстракта удаляют остатки размолотого зерна, Приготавливают реакционную смесь, содержащую НАДМ:ФМН-оксидоредуктазу, .люциферазу и субстраты ФМН, НАДН и RCOHо Реакцию инициируют добавлением НАДН и измеряют интенсивность био- люминесценции на специальном приборе - биолюминометре, который состоит из кюветной части, фотоэлектроумножите- ля, усилителя фототока и регистрирующего устройства (самописец, осциллог- раф и т.п.),

Как видно из зависимости, представленной на чертеже, в течение некоторого времени после начала реакции интенсивность свечения растет, дости- гает своего максимального значения и затем начинает медленно падать. Через 20-30 с после достижения максимума биолюминесценции измеряют величину IK и затем в реакционную смесь добав- ляют водный экстракт зерна, наблюдают при этом снижение интенсивности биолюминесценции, измеряют 10 и по величине отношения IO/IK судят о степени поражения зерна; чем меньше вели- чина 10/1К, тем сильнее поражено зерно.

Пример 1, Водные экстракты зерна кукурузы приготавливают следующим образом: к 10 кг размолотого зерна добавляют 30 мл , экстрагируют при постоянном встряхивании на качалке в течение 1 ч и центрифугируют 5 мин при 5 тыс.оборотов в 1 мин.

Для измерения интенсивности свечения приготавливают реакционную смесь, содержащую 50 мкл раствора НАДН:ФМН- оксидоредуктазы (О,1 ед. активности в 1 мл), люциферазы (0,3 мг/мл) и ФМН (),50 мкл 0,0025%-ного раствора тетрадеканаля, 200 мкл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8, 200 мкл раствора НАДН, Интенсивность свечения этой реакционной смеси измеряют на биолюминометре в условных единицах, В отсутствие водного экстракта (контроль) интенсивность свечения 1К 37 усл.ед.

При внесении в реакционную смесь 20 мкл водных экстрактов кукурузы, зараженной в разной степени метаболитами грибов, интенсивность свечения падает, измеряют 10.

В табл.1 представлены примеры реализации способа для образцов зерна кукурузы.

Точность метода определяли, измеряя среднеквадратичную ошибку в серии из 3-5 измерений для каждого образца. Из табл. видно, что ошибка не превышает 10%, Таким образом, точность метода увеличена по сравнению с прототипом в 2,5-3 раза, время анализа сокращено до 1 ч, т.е. в 6-7 раз метод прост в исполнении, уменьшены трудовые затраты по сравнению с прототипом.

Пример 2, В табл.2 представлены примеры реализации способа при добавлении в реакционную смесь разных количеств водных экстрактов кукурузы образца № 3 (количество грибов - 444,5 тыс/г, содержание ЗФС - 1040 мг/кг).

Как видно из приведенных данных, реализация предлагаемого способа не зависит от количества добавляемого экстракта зерна.

Таким образом предлагаемый способ позволяет при использовании разных количеств экстракта зерна повысить точность определения и уменьшить временные и трудовые затраты.

Пример, 3, Водные экстракты нормальной и плесневелой пшеницы приготавливают следующим образом: к 3 г размолотого зерна добавляют 9 мл

дН,0, экстрагируют при постоянном встряхивании на качалке в течение 10,30,60 мин при 30°С. Далее экстракты центрифугируют при 5 тыс.оборотов в 1 мин в течение 5 мин, либо фильтруют через бумажный фильтр.

Для измерения биолюминесценции приготавливают реакционную смесь, содержащую 50 мкл раствора НАДН:ФМН оксидоредуктазы (0,01 ед. активности в 1 мл) люцифераэы (0,015 мг/мл), ФМН О,7.), 50 мкл 0,0025%-ного раствора тетрадеканаля, 500 мкл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, 200 мкл

НАДН (4«10 М). Интенсивность свечения этой реакционной смеси измеряют в условных единицах на биолюминометре,

10 мкл экстрактов зерна добавляют в реакционную смесь после достижения постоянной интенсивности биолюминес- ценции (1К) и измеряют 10 после достижения нового уровня интенсивности свечения в присутствии экстракта,

В табл.3 представлены примеры реализации способа в зависимости от времени экстракции.

Из табл.3 видно, что результаты реализации способа практически не зависят от времени экстракции, от приема отделения остатков зерна: центрифугированием или фильтрацией.

Данные по определению количества белка в экстрактах, приведенные в - табл.З, свидетельствуют о том, что на результаты определения не влияют время приготовления экстракта и способ отделения обломков зерна (содержание белка в экстрактах практически одинаково).

Пример4, В табл.4 представлены примеры реализации способа для водных экстрактов зерна кукурузы, зараженного в разной степени микроскопическими грибами. Приемы измерения свечения аналогичны приведенным в примере 3, В реакционную смесь добавляют 20 мкл водного экстракта кукурузы.

Из табл.4 видно, что имеется связь между количеством грибов, содержанием ЗФС и величиной 10/ТК (с увеличением степени поражения зерна величина IO/IK уменьшается).

Пример5. В табл,5 представлены примеры реализации способа для пшеницы. Условия измерения аналогичны примеру 3. Б реакционную смесь добавляют 5 и 10 мкл водного экстракта пшеницы.

155

2t6

Как видно из табл.5, с увеличением количества фузариозных зерен возрастает степень ингибирования биолюминесценции.

Таким образом, сравнение примеров 1,2 . и пр-меров 3,4,5, осуществленных при разном выборе соотношения компонентов, входящих в реакционную

смесь, показывает, что от выбора соотношения компонентов, входящих в реакционную смесь, не влияет на результаты определения. Так как измерения степени поражения зерна всегда проводят по величине относительного изменения интенсивности свечения - 10/1ц , то абсолютные величины 10 ti IK не имеют значения при реализации способа,

Примерб.В табл.6 представлены примеры реализации способа для разных количеств водного экстракта нормальной и фузариозной (30% фузариозных зерен)пшеницы. Условия иэме- рения аналогичны примеру J.

Как видно из данных табл.6 предлагаемый способ реализуется при разных количествах экстракта зерна пшеницы, добавляемого в реакционною смесь. Однако в зависимости от сорта, вида зерна может меняться вел гчина 1д/1, Количество экстракта подбирается экспериментально .

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить точность измерения в 3-4 раза (ошибка измерений не превышает 10%), уменьшить трудовые затраты. Предлагаемый способ является экспресс-методом (время одного измерения 1-1,2 ч), прост, доступен, может быть использован для рутинных измерений,

Формула изобретения

Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, заключающийся в размалывании зерна, приготовлении экстракта, введении его реакционную смесь и определении в экстракте наличия грибных метаболитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и упрощения способа, в качестве реакционной смеси используют смесь, содержащую НАДН:ФМН-оксидо- редуктазу, люциферазу и их субстра .- ты, наличие метаболитов в экстракте определяют по интенсивности их свечения, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивностей биолюминесценции реакционной смеси в

присутствии экстрактов зерна и без него.

Таблица 1

91557521

Таблица 5

10/1К,% 5 мкл10 мкл

85 76 18 20

44,4

7

5,5

10

10

10

15

У

10

±