СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для выявления больного и инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

В Российской Федерации диагностические исследования на лейкоз проводят серологическими (РИД, ИФА), молекулярно-биологическим (ПЦР), гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, а также биопробой (Методические указания по диагностике лейкоза крупного скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. - 2000 - №13-7-2/2130).

Реакция иммунодиффузии (РИД) основана на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. РИД-положительных животных относят к группе с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада. Однако при данном методе диагностики возможны неспецифические (перекрестные) реакции, связанные с пролонгированной латентностью инфекционного процесса и/или низкой критической массой возбудителя, инфекционностью последнего, или по причине физиологического состояния (до и после отела), которое сопровождается перемещением защитных антител из сыворотки крови в молозиво, а также иммунологической супрессией, инициированной воздействием негативных факторов внешней среды, паразитозами, сопутствующими инфекциями, многочисленными вакцинными нагрузками (Возможности и ограничения использования полимеразной цепной реакции в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / С.В.Чичинина, В.В.Храмцов и др. // Вестн. Российской Академии сельскохозяйственных наук. - 2006. - №6. - С 71-73). Также существуют особые варианты (генотипы) вируса, при инфицировании которыми животные остаются РИД-отрицательными в течение всего периода инфицирования, и даже в случае прогрессии заболевания (Licursi М. et al. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts//Virus Research. 2002. V. 86).

Другим методом диагностики лейкоза, наряду с РИД, является иммуноферментный анализ (ИФА). Метод основан на иммунохимической реакции взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или антигенов. Этот метод позволяет выявлять антитела в низких титрах (ниже предела чувствительности РИД). Метод не получил широкого практического применения по причине отсутствия тест-систем, которые бы обрели форму завершенного ИФА-набора, выпускаемого на регулярной основе (Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / О.А.Верховский, В.В.Цибезов и др. // Ветеринария. - 2002. - №12. - С.8-10).

Существует метод диагностики с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данный метод позволяет обнаружить провирусную ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота через 1-2 недели после заражения и определить животных, которые в серологических тестах реагируют отрицательно. Однако метод ПЦР требует дорогостоящего оборудования и используется в России в основном в научных целях.

Для диагностики больных лейкозом животных, а также с целью дифференциальной диагностики форм и стадий болезни, используют гематологический метод исследования. Метод заключается в подсчете количества лейкоцитов в единице объема крови (1 мкл) и качественной оценке лимфоидных элементов - лимфоцитов. Гематологическому исследованию подвергают животных, в сыворотке крови которых серологическим методом обнаружены специфические антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Фазово-контрастным микроскопированием проб крови в камере Горяева дифференцируют лимфоциты от остальных лейкоцитов и получают соответственно показатель абсолютного содержания лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мкл крови. Эти значения затем оценивают по «лейкозному ключу».

Используемый для прижизненной диагностики гематологический метод позволяет выявить только 60 - 65% больных лейкозом. 35 - 40% животных не имеют лейкозных изменений, и это затрудняет эффект проводимых оздоровительных мероприятий. Из хозяйств выбывают животные с лейкемоидными реакциями, а больные лейкозом нередко остаются (Нахмансон В.М. Меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота из генетически устойчивых линий и семейств / В.М. Нахмансон, Е.А. Дун и др. // Труды ВИЭВ. - 1986. - Т. 59. - С.82-86).

Однако указанный метод и другие методы, предусмотренные методическими указаниями, не предусматривают дифференциацию субпопуляций лимфоцитов, сведение о содержании которых в крови животных позволило бы более точно оценить иммунный статус при лейкозной инфекции крупного рогатого скота.

Задачей изобретения является повышение точности и достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Задача достигается тем, что у РИД-положительных животных проводят забор проб крови, определяют процентное содержание лимфоцитов и процентное содержание Т-лимфоцитов, определяют коэффициент отношения количества лимфоцитов к количеству Т-лимфоцитов (К_о), при К_о, равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота и выводят из стада.

Предложенный способ диагностики отличается тем, что в крови животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов в мазке крови и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, выводят коэффициент отношения (К_о):

Увеличение этого коэффициента указывает на иммунную недостаточность и является наиболее стабильным признаком в иммунной системе у инфицированных или больных лейкозом крупного рогатого скота. Если К_о≤4,2, то животное считают здоровым, если К_о≥4,3, то животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию.

Предлагаемый способ диагностики выявляет на 46,6% больше животных больных и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота, является более точным и повышает достоверность.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. Исследуют 30 коров, из которых 10 здоровых из благополучного по лейкозу крупного рогатого скота стада, 10 коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (РИД-положительные) из неблагополучного по лейкозу стада, 10 больных коров, положительно реагирующих в РИД, и подтвержденные гематологическим методом исследования. В периферической крови определяют число лейкоцитов, лимфоцитов, Т-лимфоцитов с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, Т-киллеров - непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка, Т-лимфоцитов, распознающих антигены вируса лейкоза крупного рогатого скота и В-лимфоцитов - комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка в процентах (Бажин М.А., Мироненко В.А. и другие. Методы оценки Т- и В-систем иммунитета у крупного рогатого скота при бруцеллезе и туберкулезе: методические рекомендации // Омск. - 1989. - 34 с.) (таблица 1).

Таблица 1 Средние показатели иммунологических параметров в крови крупного рогатого скота, М±m Показатели Группа животных Здоровые Инфицированные Р Больные P Лейкоциты, тыс./мкл 6,82±0,56 9,32±0,92 <0,05 15,14±2,61 <0,01 Лимфоциты, % 69±2,88 77,8±3,89 >0,05 83,2±2,77 <0,01 Т-лимфоциты, % 30,2±1,83 6,9±1,57 <0,001 11,9±2,43 <0,001 Т-киллеры, % 30,6±3,23 43,4±6,59 >0,05 30,9±6,07 >0,05 В-лимфоциты, % 29,3±3,72 50,7±2,74 <0,001 13,0±2,47 <0,01 Т-лимфоциты, распознающие антигены, % 25,6±3,00 47,4±4,8 <0,001 26,1±1,69 >0,05

Анализируют полученные данные таблицы 1 и устанавливают у инфицированных животных по отношению к здоровым достоверное увеличение числа лейкоцитов, В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов, распознающих антигены вируса лейкоза крупного рогатого скота. У больных животных по отношению к здоровым устанавливают достоверное увеличение числа лейкоцитов, общего числа лимфоцитов. Содержание В-лимфоцитов у инфицированных коров значительно повышается (Р<0,001), тогда как у больных значительно снижается (Р<0,001). Общим признаком для инфицированных и больных лейкозом крупного рогатого скота устанавливают значительное снижение содержания Т-лимфоцитов (Р<0,001). У таких животных отмечалась либо потеря, либо крайне низкая способность (до 18% у одного животного) образовывать Е-розетки с эритроцитами барана. Таких среди инфицированных коров 90% и среди больных 80%.

Эти результаты согласуются с данными В.Н.Шабалина и Л.Д.Серовой, по мнению которых лимфобласты большинства больных острым лимфобластным лейкозом не образуют Е-розетки (В.Н.Шабалин, Л.Д.Серова. Клиническая иммуногематология. - Л.: Медицина, 1988. - С.171-173). По-видимому, у Т-лимфоцитов, пораженных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, снижается экспрессия рецепторов Т-лимфоцитов к эритроцитам барана, в то же время антитела к вирусу лейкоза и циркулирующие иммунные комплексы блокируют эти рецепторы, что препятствует реакции спонтанного розеткообразования.

Известно, что в неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйствах с высокой заболеваемостью имеются группы животных с иммунодефицитом, который проявляется нарушением соотношения Т- и В-субпопуляций иммунокомпетентных клеток, содержанием лимфоцитов с рецепторным фенотипом, характерным для недифференцированных клеток, неспособных выполнять иммунологические функции (В.А.Крикун, М.И.Гулюкин. Научно-практическое значение вирусо-иммуногенетической теории В.П.Шишкова в изучении лейкоза крупного рогатого скота // Труды ВИЭВ. - 1999. - Т.72. - С.12-15). Все эти симптомы приобретают большую диагностическую значимость, их появление и нарастание свидетельствуют о развитии иммунной недостаточности и предрасположенности к заболеванию лейкозом.

Проводят исследования по определению коэффициента отношения процентного содержания лимфоцитов к различным субпопуляциям лимфоцитов (Т-, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, распознающие антигены, и Т-киллеры) для установления наиболее стабильного признака, отражающего иммунный статус животных (таблица 2).

Таблица 2 Коэффициенты отношений лимфоцитов в процентах к субпопуляциям иммунокомпетентных клеток, M±m Отношение Здоровые Инфицированные P Больные P Лимфоциты/Т-лимфоциты 2,27±0,18 16,59±3,49 <0,01 6,42±0,91 <0,01 Лимфоциты/Т-киллеры 2,53±0,31 2,12±0,29 >0,05 4,15±1,54 >0,05 Лимфоциты/В-лимфоциты 2,50±0,32 1,59±0,14 <0,05 7,48±1,35 <0,01 Лимфоциты/Т-лимфоциты,           распознающие антиген 2,96±0,32 1,81±0,22 <0,01 3,34±0,30 >0,05

Из таблицы 2 видно, что К_о лимфоцитов к Т-киллерам у инфицированных и больных по отношению к здоровым животным не достигает достоверного различия. К_о лимфоцитов к В-лимфоцитам у инфицированных достоверно уменьшается, тогда как у больных увеличивается. К_о лимфоцитов к Т-лимфоцитам, распознающим антигены вируса лейкоза, у инфицированных достоверно уменьшается, а у больных не достигает достоверного различия. Экспериментально установлено, что наиболее стабильным, информативным признаком, отражающим иммунный статус животных, является процентное отношение числа лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов.

Анализируют иммунологические параметры каждого отдельного животного и устанавливают, что отношение лимфоцитов к Т-лимфоцитам среди здоровых не превышает 3,5, среди инфицированных от 4,3 и выше и среди больных варьирует от 4,88 до 16,4.

Например, у больной коровы в крови определено 96% лимфоцитов, методом спонтанного розеткообразования 9% Т-лимфоцитов подставляем полученные данные в формулу

Отношение лимфоцитов к В-лимфоцитам среди здоровых и инфицированных не имеет существенных различий и варьирует от 0,77 до 4,55, в то время как у большинства больных это отношение увеличивается. Отношение лимфоцитов к Т-киллерам и лимфоцитов к Т-лимфоцитам, распознающим антигены вируса лейкоза, среди здоровых, инфицированных и больных животных варьирует в одних пределах и не представляется возможным выделить какой-либо признак различий.

Следовательно, дифференциация субпопуляций лимфоцитов в крови животных позволяет более точно оценить иммунный статус при лейкозной инфекции крупного рогатого скота. Наиболее стабильным признаком в иммунной системе больного и инфицированного лейкозом крупного рогатого скота, свидетельствующим об иммунной недостаточности, является изменение общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов с рецептором к эритроцитам барана, при этом другие иммунологические показатели (число В-лимфоцитов, Т-киллеров и Т-лимфоцитов, распознающих антигены вируса лейкоза) менее информативны и не позволяют с высокой точностью выявить больной или с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупный рогатый скот.

Пример 2. В условиях хозяйства, неблагополучного по лейкозу крупного рогатого скота, исследуют телят, полученных от матерей-вирусоносителей, в возрасте 4-6 месяцев, 12-14 месяцев в сравнении с телятами этих же возрастных групп из благополучного по лейкозу крупного рогатого скота хозяйства (таблица 3). Телята всех возрастных групп не реагировали в РИД. В крови определяют коэффициент отношения процентного содержания лимфоцитов к Т-лимфоцитам.

В возрасте 4-6 месяцев у одного из 15 животных, полученных от матерей-вирусоносителей, К_o=17,0, у остальных - до 3,42. В дальнейшем этих телят подвергли гематологическому методу исследования и выявили того же самого животного, что подтверждает диагноз. У 15 телят из благополучного хозяйства К_o варьировал в пределах от 1,08 до 3,6 и указывал на отсутствие у животных вируса лейкоза.

У 14 животных в возрасте 12-14 месяцев из неблагополучного хозяйства К_o составил от 4,35 и выше (93,3%). Дальнейшее гематологическое исследование позволило выявить 7 больных, из числа 14 животных, у которых K_o составил выше 4,3. У 15 телят этого же возраста из благополучного хозяйства К_o варьировал в пределах от 1,10 до 2,31.

Также исследуют 20 коров, которые содержались в пункте по передержке инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота, заражение которого было выявлено серологически (РИД). К_о содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов у 18 коров составил от 4,31 до 41,5, что свидетельствовало о повышенном риске к заболеванию лейкозом, у 2-х - 2,96 и 2,62 соответственно. В последующем при исследовании гематологическим методом диагноз на лейкоз подтвержден у 11 коров. У 20 коров из благополучного хозяйства это отношение варьировало в пределах от 2,50 до 3,93 (таблица 3).

Таблица 3 Результаты исследования животных различных возрастных групп в неблагополучном хозяйстве Возрастные группы Кол-во животных Выявлено РИД(+) гематологически предлагаемым способом дополнительно животных % 4-6 месяцев 15 - 1 1 - - 12-14 месяцев 15 - 7 14 +7 +46,66 коровы 20 20 11 18 -2 - 10,0

Из таблицы 3 видно, что в возрастной группе 12-14 месяцев из 15 животных в РИД не выявлено инфицированных животных, гематологическим методом выявлено 7 животных, предлагаемым методом 14 животных, что позволило выявить дополнительно 7 животных (46,66%). Среди 20 коров в РИД выявлено 20 инфицированных животных, гематологическим методом 11, предлагаемым методом - 18, в результате чего выделено 2 (10%) животных, не являющихся инфицированными и гематологически больными, а положительная реакция в РИД, вероятно, связана с неспецифическими реакциями. Таким образом, предлагаемый способ диагностики позволяет дополнительно выявить до 46,66% больных и с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота, является более точным и достоверным.

Изобретение относится к ветеринарии. Предложен способ для выявления больного и инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота. В крови животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования, определяют коэффициент отношения (К_о) содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов при К_о, равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Способ позволяет повысить достоверность и точность диагностики. 3 табл.

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных и гематологический метод исследования, отличающийся тем, что у инфицированных животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов в мазке крови и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, определяют коэффициент отношения (К_о) содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов, при К_о, равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота и выводят из стада.