СПОСОБ ОЦЕНКИ ГОДНОСТИ БИОПРЕПАРАТА Российский патент 1997 года по МПК G01N24/08 G01N33/487 

Изобретение относится к измерительной технике, в частности, к физическим методам исследования веществ, и может использоваться в биологии, медицине и ветеринарии для проверки биологической активности вакцин, сывороток и других лекарственных препаратов.

Известен метод электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы для разделения смесей биополимеров, оценки их нативной структуры и активности.

Недостатком известного метода является длительность процедуры проведения электрофореза (не менее 30 мин), большое число подготовительных операций, что осложняет автоматизацию способа, а также требует большого количества реактивов и оборудования для проведения анализа.

Технической задачей данного изобретения является ускорение процедуры проверки активности биопрепаратов путем обеспечения возможности ее автоматизации.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе оценки годности биопрепарата, включающем анализ раствора биопрепарата, анализ осуществляют путем измерения времени продольной и/или поперечной релаксации ядер веществ, содержащихся в растворе биопрепарата, которое сравнивают с эталонным, и по результатам сравнения делают заключение об активности биопрепарата и оценивают его годность.

Способ оценки годности биопрепарата реализуется следующим образом.

Лиофилизированный и запаянный в стеклянной ампуле биопрепарат перед измерениями растворяют в обычно используемом растворителе, например, в физиологическом растворе РингераЛокка, до заданной концентрации. Дозированное количество полученного (или уже готового) раствора вводят в рабочую ампулу автоматизированного релаксометра ядерно-магнитного резонанса (ЯМР-релаксометра) и определяют время Т₁ и/или Т₂ - соответственно продольной и поперечной релаксации. Полученные значения сравнивают с эталонными значениями Т₁ и/или Т₂ для данного биопрепарата либо используют калибровочные графики и по этим данным делают вывод о годности исследуемого препарата и его активности.

Для проведения анализа достаточно 5 мин, не считая времени предварительного разогрева образцов, когда рабочая температура магнита в приборе превышает температуру окружающей среды. При этом, как правило, определяют время релаксации протонов в растворе, однако возможно растворение вакцин и сывороток в тяжелой воде (Д₂О) и измерение времени релаксации дейтронов, что еще больше ускоряет анализ.

Возможно также измерение времен релаксации ядер ²³Na (при растворении препаратов в физиологическом растворе Рингера-Локка), так как механизмы, определяющие значения времен релаксации всех этих ядер в растворе близки, и значения Т₁ и Т₂ зависят от взаимодействия и характера обмена молекул растворителя с макромолекулами биополимеров.

Способ иллюстрируется примерами. При проверке активности и при определении годности препаратов брались образцы из партий вакцин, сывороток с установленной активностью и с известной датой изготовления, причем для проверки воспроизводимости метода из каждой партии бралось 4-5 образцов. Измерение времен релаксации проводились на отечественном ЯМР-релаксометре "Пальма". Прибор снабжен автоматом смены проб на 15 позиций, обеспечивающим термостабилизацию исследуемых образцов с точностью 0,1^oС при рабочей температуре 40^oС, последовательную подачу образцов в датчик и измерение Т₁ с точностью не хуже 2% Рабочий объем ампулы 0,2 мл.

Пример 1. Определение активности вакцин коклюша.

Препарат выпускается серийно в стеклянных ампулах, содержащих 50 мг сухого препарата. Непосредственно перед измерениями ампулы были вскрыты, и в них дозатором на 250 мкл введен фосфатный буфер 0,05 М с рН 7,4. Препарат растворился практически мгновенно, и приготовленный раствор через 1-2 мин был введен в рабочую ампулу релаксометра. Были использованы образцы вакцины 1988-1991 года выпуска с известной активностью, установленной по стандартной методике с использованием лабораторных животных (мышей). Измерения Т₁ в 4 сериях образцов вакцин вместе с датой изготовления, средними значениями Т₁ в сериях, средней квадратичной погрешностью определения Т₁ в сериях (G) и количеством исследованных образцов приведены в таблице. Данные, приведенные в таблице, говорят о том, что разведение препаратов дает хорошо воспроизводимые результаты для каждой серии и разброс измеренных значений Т₁ в каждой серии не превышает 6,5% (по величине относительной погрешности, серия N 32).

Данные, приведенные в таблице, подтверждают, что имеется однозначная связь между средним значением Т₁ в серии и датой выпуска образца и его активностью чем больше значение Т в растворе, тем выше активность вакцины.

Пример 2. Оценка годности препарата сывороточного альбумина человека (САЧ).

Для исследований были использованы образцы САЧ венгерской фирмы "Reanal" выпуска 1982 и 1984 г. хранившиеся в стандартных условиях до мая 1985 г. Навески белка по 20±0,1 мг растворяли в 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,3. Для каждого образца САЧ было приготовлено по 4 раствора. Среднее значение Т в образцах белка 1982 г. составило Т₁ 1900±95 мс, среднее значение для растворов 1984 г. составило Т₁ 2300±120 мс. Эти измерения проводились в феврале и марте 1985 г. на релаксометре "Minispec" рС-20". Сохранение нативной информации САЧ и его биологическая активность оценивались по скорости расщепления САЧ трипсином в условиях: 0,5 мл раствора +0,2 мл 0,1М трис НС буфера, рН=7,6, содержащего 500j трипсина. Скорость деградации САЧ (1982 г.) была на 20% выше, чем в случае САЧ (1984 г.), что связано с большей доступностью для трипсина соответствующих связей между доменами.

Пример 3. Оценка годности препарата сывороточного альбумина человека по значению Т₂.

В тех же образцах, что и в примере 2, на приборе "Mini- spec" с помощью стандартной последовательности Карра-ПарселаМейбума были измерены значения Т₂. Время измерения Т₂м образце с точностью не хуже 2% менее трех минут.

Для образцов 1982 г. Т₂ 800±90 мс (среднее для 4 образцов).

Для образцов 1984 г. Т₂ 1200±100 мс (среднее для 4 образцов).

Пример 4. Оценка годности САЧ по значению Т₁ ядер дейтерия.

Те же образцы лиофилизированного САЧ были растворены в 0,9%-ном растворе NaCl в тяжелой воде (Д₂О). Всего было приготовлено по два образца с концентрацией биополимера С 5%± 0,06 (массовое отношение). Измерения Т₁ дейтронов были выполнены на релаксометре "ВКР-322S" при ≈ 40^oС на рабочей частоте 6,3 МГц, время измерения для одного образца менее 2 мин.

В образцах 1982 г. Т₁ 180± 20 мс.

В образцах 1984 г. Т₁ 240±35 мс.

Из приведенных примеров видно, что во всех случаях существует однозначная зависимость между измеряемыми ЯМР-параметрами Т₁, Т₂ различных рабочих ядер, годом выпуска препарата и его биологической структурой и активностью. При этом среднеквадратичная погрешность значений времен релаксации в сериях растворов препаратов мала, что позволяет достичь достаточно высокой разрешающей способности метода при оценке срока годности или активности биопрепарата. Поскольку многие препараты медицинского назначения выпускаются в виде растворов в ампулах, то практическая реализация метода не требует дополнительных операций по приготовлению растворов. Приведенные примеры, иллюстрирующие реализацию предлагаемого способа, не ограничивают все его возможности, и он может быть расширен за счет вариации таких параметров, как температура, состав растворителя и рабочие ядра.

Использование: изобретение относится к измерительной технике, в частности, к физическим методам исследования веществ, и может использоваться для проверки биологической активности вакцин, сывороток и других лекарственных препаратов. Сущность изобретения: анализ осуществляется путем измерения времени продольной и/или поперечной релаксации ядер веществ, содержащихся в растворе биопрепарата, которое сравнивают с эталонным значением, и по результатам сравнения делают заключение об активности биопрепарата и оценивают его годность. 1 табл.

Способ оценки годности биопрепарата, включающий анализ раствора биопрепарата, отличающийся тем, что анализ осуществляют путем измерения времени продольной и/или поперечной релаксации ядер веществ, содержащихся в растворе биопрепарата, которое сравнивают с эталонным значением, и по результатам сравнения делают заключение об активности биопрепарата и оценивают его годность.