Коньюгат на основе магнитных наночастиц для терапии солидных опухолей и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК A61K47/02 A61K47/10 A61P35/00 B82B3/00 B82Y5/00 

Онкологические заболевания занимают 2 место среди причин смерти после заболеваний кровеносной системы. Поэтому в настоящее время огромное внимание уделяется повышению эффективности и уменьшению токсичности известных противоопухолевых препаратов (Dox, Ptx, Mtx, Cpt и др.), в частности, созданию новых средств их доставки в опухолевые ткани [Gao Q., Feng J., Liu W., Wen C., Wu Y., Liao Q., Zou L., Sui X., Xie T., Zhang J., Hu Y. Opportunities and challenges for co-delivery nanomedicines based on combination of phytochemicals with chemotherapeutic drugs in cancer treatment // Adv. Drug Deliv. Rev. 2022. 188. 114445]. В данных целях разрабатываются материалы на основе магнитных наночастиц (МНЧ), наночастиц золота, серебра, углеродных, полимерных, квантовых точек, липосом и др., в том числе обладающих уникальными свойствами, которые позволяют реализовать специфические методы диагностики или лечения рака [Carrese B., Sanità G., Lamberti A. Nanoparticles design for theranostic approach in cancer disease // Cancers. 2022. 14. 4462]. Наиболее перспективными являются гибридные наноматериалы, сочетающие в себе неорганические и органические компоненты, например, частицы “core-shell”- типа, имеющие ядра (одно или несколько) на основе каких-либо металлических или оксидных наночастиц, которые покрыты SiO₂- и/или полимерной оболочкой и конъюгированны с другими функциональными компонентами (молекулами флуоресцентных красителей, квантовыми точками, радионуклидными метками, молекулярными векторами). Кроме того, такие материалы могут быть загружены лекарственными препаратами, в том числе противоопухолевыми [Gareev K.G., Grouzdev D.S., Koziaeva V.V., Sitkov N.O., Gao H., Zimina T.M., Shevtsov M. Biomimetic nanomaterials: Diversity, technology, and biomedical applications // Nanomaterials. 2022. 12. 2485; Thorat N.D., Townley H.E., Patil R.M., Tofail S.A.M., Bauer J. Comprehensive approach of hybrid nanoplatforms in drug delivery and theranostics to combat cancer // Drug Discov. Today. 2020. 25. 1245-1252].

Немаловажным в создании наноматериалов для медицинского применения является выбор природы ядра наночастиц или их покрытия. Одним из наиболее часто используемых в этих целях материалов является мезопористый SiO₂, характеризующийся биосовместимостью и высокой сорбционной емкостью в отношении противоопухолевых препаратов [Taleghani A.S., Nakhjiri A.T., Khakzad M.J., Rezayat S.M., Ebrahimnejad P., Heydarinasab A., Akbarzadeh A., Marjani A. Mesoporous silica nanoparticles as a versatile nanocarrier for cancer treatment: A review // J. Molecular Liquid. 2021. 328. 115417]. Дополнительно наночастицы могут быть покрыты биосовместимым полимером - полиэтиленгликолем (ПЭГ), молекулы которого, как известно, повышают агрегативную стабильность наночастиц и придают частицам «stealth»-эффект, который предотвращает их распознавание мононуклеарными фагоцитами в организме [Dong, X.-J.; Zhang, Z.-L.; Wu, L.-L.; Ma, X.-Y.; Xu, C.-M.; Pang, D.-W. Coating magnetic nanospheres with PEG to reduce nonspecific adsorption on cells // ACS Omega 2019. 4. 7391-7399]. В результате, можно достигать увеличения времени циркуляции наноматериала в крови и, таким образом, увеличивать терапевтический эффект препарата.

Известна система доставки лекарственных средств на основе наночастиц мезопористого SiO₂ поверхностно модифицированных цистеином и сорбированным доксорубицином (Dox) [Hu L.-L., Meng J., Zhang D.-D., Chen M.-L., Shu Y., Wang J.-H., Functionalization of mesoporous organosilica nanocarrier for pH/glutathione dual-responsive drug delivery and imaging of cancer therapy process // Talanta 2018. 177. 203-211]. Наноконъюгат имеет высокий уровень загрузки препарата (260 мкг/мг) и обладает способность к повышенному высвобождению препарата в присутствии глутатиона и пониженного рН (5.0), свойственных опухолевым тканям. Терапевтический эффект продемонстрирован на клеточной линии A549. Известна композиция на основе полых наносфер из мезопористого SiO₂ с ПЭГ-покрытием и сорбированным Dox [Nguyen T.N.T., Nguyen-Tran D.-H., Bach L.G., Truong T.H.D., Le N.T.T., Nguyen D.H. Surface PEGylation of hollow mesoporous silica nanoparticles via aminated intermediate // Prog. Nat. Sci.: Materials International 2019, 29, 612-616]. Композиция имеет относительно высокий уровень загрузки препарата (104 мкг/мг), при этом было продемонстрировано, что он оказался в 2 раза выше, чем у аналогичных частиц, но без ПЭГ-покрытия. Терапевтический эффект для данных материалов не изучался. Также известен конъюгат на основе наночастиц мезопористого SiO₂ с ПЭГ-покрытием и сорбированным Dox [Zhang Y., Dang M., Tian Y., Zhu Y., Liu W., Tian W., Su Y. Ni Q., Xu C., Lu N., Tao J., Li Y., Zhao S., Zhao Y., Yang Z., Sun L., Teng Z., Lu G. Tumor acidic microenvironment targeted drug delivery based on pHLIP modified mesoporous organosilica nanoparticles // ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 30543-30552]. Данный наноконъюгат обладает высоким уровнем загрузки препарата (334 мкг/мг). Продемонстрировано рН-зависимое высвобождение Dox, а именно, препарат лучше высвобождался при рН 5.0, свойственной опухолевым тканям, чем при рН 7.4, характерной для здоровых тканей. Показан цитотоксический эффект в опытах in vitro в отношении клеток опухолевых линий MDA-MB-231 и MCF-7, а также терапевтический эффект в опытах in vivo на мышах с перевитой опухолью MCF-7. Основным недостатком вышеописанных материалов является отсутствие в их составе магнитных наночастиц, обеспечивающих возможность проведения гипертермии, позволяющей увеличивать эффективность терапевтического эффекта или дополнительного мониторинга распределения частиц в организме с использованием МРТ.

Наличие магнитных ядер (в большинстве случаев это магнетит Fe₃O₄ или маггемит (γ-Fe₂O₃)) в наноконъюгатах одновременно позволяет визуализировать их распределение в организме методами магнито-резонансной томографии [Liu D., Li J., Wang C., An L., Lin J., Tian Q., Yang S. Ultrasmall Fe@Fe3O4 nanoparticles as T1-T2 dual-mode MRI contrast agents for targeted tumor imaging // Nanomed. NBM 2021. 32. 102335] или магнитной визуализации частиц [Bulte J.W.M. Superparamagnetic iron oxides as MPI tracers: A primer and review of early applications // Adv. Drug Deliv. Rev. 2019. 138. 293-301], а также проводить терапию опухолей за счет разогревания тканей высокочастотным магнитным полем до температуры выше 42°С (эффект магнитной гипертермии) [Liu X., Zhang Y., Wang Y., Zhu W., Li G., Ma X., Zhang Y., Chen S., Tiwari S., Shi K., Zhang S., Fan H.M., Zhao Y.X., Liang X.-J. Comprehensive understanding of magnetic hyperthermia for improving antitumor therapeutic efficacy // Theranostics 2020. 10. 3793-3815; US2014302154 (A1); JP2009280505 (A); KR20190010509 (A); US2014378818 (A1); US2018050218 (A1); US2012283504 (A1); US2016129275 (A1); RU2010111377 (A); CN108109805 (A)], облучением светом в ближней инфракрасной области (фототермальный эффект) [Dai Z., Wen W., Guo Z., Song X.-Z., Zheng K., Xu X., Qi X., Tan Z. SiO2-coated magnetic nano-Fe3O4 photosensitizer for synergistic tumour targeted chemo-photothermal therapy // Colloids. Surf., B. 2020. 195. 111274], микроволновым излучением [US2017265803 (A1)] или высокоинтенсивным сфокусированным ультразвуком [Novoselova M.V., German S.V., Abakumova T.O., Perevoschikov S.V., Sergeeva O.V., Nesterchuk M.V., Efimova O.I., Petrov K.S., Chernyshev V.S., Zatsepin T.S., Gorin D.A. Multifunctional nanostructured drug delivery carriers for cancer therapy: Multimodal imaging and ultrasound-induced drug release // Colloids. Surf., B. 2021. 200. 111576]. Известен подход к магнитно-активируемому разрушению раковых клеток, за счет инициации контролируемого вращения МНЧ под воздействием магнитных полей [CA2997318 (A1)]. Предложены МНЧ, инициирующие гибель клеток в результате активации генерации активных форм кислорода при разогревании наночастиц в магнитном поле [WO2019072885 (A1)].

Наноконъюгаты на основе МНЧ имеют способность к направленному движению и удержанию в тканях при использовании магнитного поля [US2012003321 (A1)], выраженную способность к рН- [Javanbakht S., Shadi M., Mohammadian R., Shaabani A., Ghorbani M., Rabiee G., Amini M.M. Preparation of Fe₃O₄@SiO₂@Tannic acid double core-shell magnetic nanoparticles via the Ugi multicomponent reaction strategy as a pH-responsive co-delivery of doxorubicin and methotrexate // Mater. Chem. Phys. 2020. 247. 122857] или магнитоопосредованному [Guisasola E., Asín L., Beola L., de la Fuente J.M., Baeza A., Vallet-Regí M. Beyond traditional hyperthermia. In vivo cancer treatment with magnetic-responsive mesoporous silica nanocarriers // ACS Appl. Mater. Interfaces 2018. 10. 12518-12525; Moros M., Idiago-López J., Asína L., Moreno-Antolín E., Beola L., Grazú V., Fratila R.M., Gutiérrez L., de la Fuente J.M. Triggering antitumoural drug release and gene expression by magnetic hyperthermia // Adv. Drug Deliv. Rev. 2019. 138. 325-342] высвобождению цитостатических препаратов. Это позволяет повысить накопление лекарства в опухоли, снизить токсические эффекты в отношении здоровых тканей и органов, оптимизировать фармакокинетику лекарственного препарата. В результате этого можно достигать синергетического эффекта гипертермии и химиотерапии для лечения рака.

Наноконъюгаты на основе МНЧ, предназначенные для терапии солидных опухолей, должны обладать:

- высокими значениями удельной намагниченности и SAR, чтобы иметь способность к направленному движению и удержанию в тканях при использовании магнитного поля, а также способностью разогреваться в переменном магнитном поле для реализации эффекта гипертермии;

- высокой сорбционной емкостью по отношению к противоопухолевым препаратам;

- способностью к рН- или магнитоопосредованному высвобождению противоопухолевым препаратов для реализации возможности их выпуска в опухолевых тканях и снижения токсических эффектов в отношении здоровых тканей и органов;

- стабильностью их коллоидных растворов в водных средах для обеспечения возможности внутриопухолевого или внутривенного введения препарата.

Известен конъюгат на основе МНЧ Fe₃O₄, покрытых мезопористым SiO₂ и сорбированным Dox [Zhu Y., Tao C. DNA-capped Fe₃O₄/SiO₂ magnetic mesoporous silica nanoparticles for potential controlled drug release and hyperthermia. RSC Adv. 2015. 5. 22365-22372]. Продемонстрирована возможность рН-опосредованного высвобождения Dox, а также способность наночастиц к разогреву в переменном магнитном поле (SAR 1.44-8.74 Вт/г, 90-180 Гс, 409 кГц). Тем не менее, уровень загрузки препарата был относительно низким (40 мкг/мг), а терапевтический эффект не изучен.

Известен конъюгат на основе МНЧ Fe₃O₄ с SiO₂-покрытием, на котором ковалентно (за счет использования 3-аминопропилтриэтоксисилана) закреплена таниновая кислота и сорбированы два противоопухолевых препарата Dox и метотрексат (MTX) [Javanbakht S., Shadi M., Mohammadian R., Shaabani A., Ghorbani M., Rabiee G., Amini M.M. Preparation of Fe₃O₄@SiO₂@Tannic acid double core-shell magnetic nanoparticles via the Ugi multicomponent reaction strategy as a pH-responsive co-delivery of doxorubicin and methotrexate. Mater. Chem. Phys. 2020. 247. 122857]. Количество сорбированных препаратов составляло 33 и 82 мкг/мг для Dox и MTX соответственно. Продемонстрировано рН-опосредованное выделение для обоих препаратов (выделение при рН 5.0 происходило лучше, чем при рН 7.4), а также цитотоксический эффект на клетках рака молочной железы линии MCF-7. Недостатком является отсутствие исследований поведения данного конъюгата в переменном магнитном поле, в частности, гипертермический эффект.

Известны МНЧ Fe₃O₄ с аминированным SiO₂-покрытием, полученным с использованием различных количеств тераметилортосиликата, и сорбированным Dox (до 340 мкг/мг) [Демин А. М., Вахрушев А. В., Валова М. С., Минин А. С., Кузнецов Д. К., Уймин М. А., Шур В. Я., Краснов В. П., Чарушин В. Н. Дизайн SiO₂/аминопропилсилан-модифицированных магнитных наночастиц Fe₃O₄ для иммобилизации на них доксорубицина // Изв. АН. Сер. хим. 2021. 5. 987-994]. Известны МНЧ Fe₃O₄ с SiO₂-покрытием, полученным, в том числе, с использованием N-фосфонометилиминодиуксусной кислоты и различных количеств тетраметилортосиликата, и сорбированным Dox (до 260 мкг/мг) [Demin A.M., Vakhrushev A.V., Valova M.S., Korolyova M.A., Uimin M.A., Minin A.S., Pozdina V.A., Byzov I.V., Tumashov A.A., Chistyakov K.A., Levit G.L., Krasnov V.P., Charushin V.N., Effect of the silica-magnetite nanocomposite coating functionalization on the doxorubicin sorption / desorption // Pharmaceutics, 2022, 14, 2271]. Однако в этих работах отсутствуют данные о терапевтическом эффекте наноконъюгатов, в том числе с использованием переменного магнитного поля.

Общим недостатком выше описанных материалов является отсутствие покрытия из ПЭГ, которое, как известно, способно придавать частицам «stealth»-эффект, т.е. предотвращать их распознавание макрофагально-моноцитарной системы крови [Arami, H.; Khandhar, A.; Liggitt, D.; Krishnan, K. M. In vivo Delivery, Pharmacokinetics, Biodistribution and Toxicity of Iron Oxide Nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 2015. 44. 8576-607; Dong, X.-J.; Zhang, Z.-L.; Wu, L.-L.; Ma, X.-Y.; Xu, C.-M.; Pang, D.-W. Coating magnetic nanospheres with PEG to reduce nonspecific adsorption on cells // ACS Omega 2019. 4. 7391-7399].

Наиболее близкими к предлагаемому техническому решению, сочетающему и SiO₂-покрытие, и ПЭГ, являются наночастицы на основе МНЧ Fe₃O₄, покрытых слоем SiO₂, со средним диаметром 13 нм (по данным просвечивающей электронной микроскопии), конденсированных с конъюгатом ПЭГ(3000) и [(3-этоксисилил)пропил]янтарной кислоты [Demin A.M., Vakhrushev A.V., Pershina A.G., Valova M.S., Efimova L.V., Syomchina A.A., Uimin M.A., Minin A.S., Levit G.L., Krasnov V.P., Charushin V.N., Magnetic-responsive doxorubicin-containing materials based on Fe₃O₄ nanoparticles with a SiO₂/PEG shell and study of their effects on cancer cell lines // Int. J. Mol. Sci., 2022, 23, 9093], которые могут быть рассмотрены как прототип.Данные наночастицы обладали достаточно высоким уровнем загрузки препарата (162 мкг/мг). Продемонстрировано рН-зависимое высвобождение Dox, а именно, препарат лучше высвобождался при рН 5.8, чем при рН 7.4, в том числе и при использовании переменного магнитного поля (27 мТл, 230 кГц). Продемонстрирована их высокая токсичность в отношении различных опухолевых клеточных линий человека и мыши (MDA-MB231, HepG2, 4T1, CT26, B16), а также эффект высвобождения препарата (в опытах с клетками линии 4Т1) при наложении переменного магнитного поля (27 мТл, 230 кГц, SAR 16.7 Вт/г), приводящего к усилению цитотоксического действия. Основным недостатком этой работы является отсутствие данных о противоопухолевой активности синтезированного конъюгата in vivo.

Раскрытие изобретения

Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа получения нового наноконъюгата на основе МНЧ оксида железа с покрытием на основе SiO₂ и ПЭГ, содержащим сорбированный противоопухолевый препарат Dox.

Поставленная задача решается путем синтеза конъюгата МНЧ на основе оксида железа, нанесению на них SiO₂-покрытия, ковалентной функционализации его молекулами ПЭГ и сорбции на них Dox, предназначенного для терапии солидных опухолей, в частности, за счет использования переменного магнитного поля (с использованием генератора переменного магнитного поля TOR UltraHT с параметрами 27 мТ, 230 кГц).

Сущность изобретения заключается в том, что конструируют наноконъюгат, в структуру которого входят ядра на основе МНЧ оксида железа, способные разогреваться в переменном магнитном поле (эффект гипертермии); SiO₂-покрытие с ковалентно закрепленными на поверхности молекулами ПЭГ, которое обеспечивает высокую сорбционную емкость материала по отношению к противоопухолевым препаратам и его стабильность в водных средах; а также сорбированный на поверхности противоопухолевый препарат Dox, обеспечивающий противоопухолевый эффект.Водные коллоидные растворы предложенного наноконъюгата могут быть применимы для терапии солидных опухолей за счет комбинирования эффекта локальной гипертермии (при применении переменного магнитного поля) и химиотерапии.

В качестве основы наноконъюгата используют МНЧ на основе оксида железа (например, на основе Fe₃O₄, γ-Fe₂O₃ или МНЧ на основе смеси этих 2-х фаз либо других фаз оксида железа, ферритов с общей формулой Me_nFe_3-nO₄, где Me=Co, Ni, Mn, Zn, Cu, Ca и др. металлы со степенью оксиления+2, а 0<n<1) или Fe⁰ с размерами приблизительно от 5 до приблизительно 20 нм (МНЧ с размерами приблизительно<5 нм могут обладать недостаточно выраженными магнитными свойствами (низким удельным коэффициентом поглощения электромагнитной энергии (SAR)) и низкой релаксивностью (r1, r2), чтобы их можно было эффективно использовать в качестве материалов для проведения гипертермии или в качестве агентов, усиливающих МРТ-сигнал, соответственно; МНЧ с размерами приблизительно>30 нм могут иметь высокие значения коэрцитивной силы, т.е. обладать магнитным моментом в отсутствии внешнего магнитного поля, что обуславливает их притягивание друг к другу и, как следствие, вызывает образование крупных агломератов с гидродинамическими размерами приблизительно>200 нм, что не приемлемо для их использования в опытах in vivo из-за того, что образованные в кровеносном русле крупные агломераты способны вызывать закупорку сосудов и приводить к некрозам тканей, либо с большой вероятность будут захвачены клетками макрофагально-моноцитарной системы (фагоцитами и др.), что приведет к уменьшению вероятности их накопления в опухолях и существенному уменьшению возможностей их детектирования и применения в терапевтических целях при проведении магнитной гипертермии. МНЧ, используемые для получения описываемого наноконъюгата, могут быть получены химическими, физическими или микробиологическими методом и иметь любую форму: сферическую и близкую к сферической, вытянутую, кубическую, сплющенную (наночашуйки). В качестве ядра описываемого наноконъюгата могут использоваться нанокластеры, включающие несколько наночастиц и объединенные в дальнейшем общей оболочкой.

На поверхности МНЧ для защиты ядра в условиях in vivo и придания большей биосовместимости формируют оболочку, например, на основе оксида кремния (SiO₂), золота (Au), углерода (С) или устойчивых в условиях in vivo полимеров (полистирол и др.). Так, например, в случае получения описываемых наноконъюгатов, создавали SiO₂-оболочку толщиной приблизительно от 1 до приблизительно 25 нм (толщина оболочки приблизительно<1 нм не способна обеспечить химическую стабильность и биологическую инертность магнитной наночастицы в составе наноконъюгата; толщина оболочки приблизительно>25 нм может создать трудности в стабилизации получаемых наноконъюгатов и, как следствие, вызывать образование крупных агломератов с гидродинамическими размерами приблизительно>200 нм, что не приемлемо для их использования в опытах in vivo по причине того, что образованные в кровеносном русле крупные агломераты способны вызывать закупорку сосудов или с будут захвачены клетками макрофагально-моноцитарной системы, что приведет к уменьшению вероятности их накопления в целевых тканях и существенному уменьшению их диагностических и терапевтических возможностей) за счет гидролиза силанов, содержащих алкоксильные группы (например, тетраметоксиортоликата (TMOS) или тетраэтоксиортоликата (TEOS)), или силиката натрия (например, Na₂SiO₃), которая обеспечивает химическую стабильность и биологическую инертность магнитной наночастицы в составе наноконъюгата, а также увеличивает количество химически активных центров для повышения эффективности последующей функционализации (повышения уровня загрузки) поверхности производными моно-, ди- и триалкоксисиланов, содержащих аминогруппы, например, (3-аминопропил)триметоксисилана (APTMS), (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTES), 3-(2-аминоэтиламино)пропилметилдиметоксисилана (APMS)).

Дополнительно на поверхности наночастиц создают ковалентно закрепленное покрытие на основе биосовместимых полимеров, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ), альбуминов, полисахаров (крахмал, декстран и др.) и их сополимеров. Так, например, в случае получения описываемых наноконъюгатов, наносили оболочку на основе ПЭГ с молярной массой от 1000 до приблизительно 10000 Да, которая способствует стабилизации наноконъюгата в водных средах, а также снижает поглощение наноконъюгата фагоцитирующими клетками в случае внутривенного введения. В случае применения ПЭГ с меньшими молекулярными массами получаемые наночастицы могли иметь низкую стабильность в водных средах, быстро агломерировать и выпадать в осадок, что ведет к сложности или даже невозможности их использования в медицинских целях. В случае применения ПЭГ с большими молекулярными массами доля МНЧ в получаемом материале достаточно мала и, соответственно, магнитные свойства таких материалов выражены слабо. В результате данные материалы лишаются выше описанных преимуществ в использовании, обусловленных наличием МНЧ в их составе. Молекула ПЭГ должна иметь в своем составе функциональную группу для конденсации с функциональными группами на поверхности наночастиц, например, свободную карбоксильную или активированную карбоксильную группу (например, в виде сукцинимидного эфира) для ковалентного связывания с аминогруппами на поверхности МНЧ (например, α-N-сукцинимидный эфир-25(этилен гликоль)-ω-O-3-пропионовая кислота (NHS-dPEG₂₅-COOH), М. 1316.47 г/моль).

Наличие в молекуле ПЭГ дополнительной функциональной группы (например, амино- или карбоксильной группы) может позволить ковалентно ввести в состав наноконъюгата диагностические метки (молекулы флуоресцентных красителей; препараты, содержащие изотопы и применяемые для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ, PET) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ или ОЭКТ, SPECT), рентгеноконтрастные препараты; молекулы, содержащие ионы, например, гадолиния (Gd), марганца (Mn) и др. (используемых для визуализации методом МРТ)) для дополнительного мониторинга распределения наночастиц описываемого наноконъюгата в организме.

Путем сорбции известного противоопухолевого препарата Dox на поверхности наночастиц получают целевой наноконъюгат, водные коллоидные растворы которого пригодны для внутривенного или внутриопухолевого введения и могут быть использованы для терапии солидных опухолей, в частности, за счет использования переменного магнитного поля (с использованием генератора переменного магнитного поля), которое приводит к локальному разогреву магнитных ядер конъюгата, что, в свою очередь, способно усилить химиотерапевтический эффект Dox.

Предлагаемый наноконъюгат является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.

По сравнению с другими близкими техническими решениями предложенный наноконъюгат имеет преимущества, которые состоят в следующем:

а) в описываемом наноконъюгате, в отличие от других близких технических решений, используется покрытие на основе SiO₂, на котором ковалентно за счет использования 3-аминопропилтриалкоксисилана закреплены молекулы ПЭГ с концевыми карбоксильными группами; т.е. совмещены свойства SiO₂-покрытия, позволяющие добиваться эффективной сорбции противоопухолевого препарата Dox, и ПЭГ-покрытия, позволяющие добиваться высокой стабильности частиц и способствующего снижению их поглощения фагоцитирующими клетками в случае внутривенного введения препарата.

б) при создании наноконъюгата, в отличие от прототипа [Demin A.M., Vakhrushev A.V., Pershina A.G., Valova M.S., Efimova L.V., Syomchina A.A., Uimin M.A., Minin A.S., Levit G.L., Krasnov V.P., Charushin V.N., Magnetic-responsive doxorubicin-containing materials based on Fe₃O₄ nanoparticles with a SiO₂/PEG shell and study of their effects on cancer cell lines // Int. J. Mol. Sci., 2022, 23, 9093], использован другой подход к модификации поверхности SiO₂-покрытия: вместо модификации SiO₂-покрытия конъюгатом ПЭГ(3000) и [(3-триэтоксисилил)пропил]глутаровой кислотой использован подход, отличающийся последовательной функционализацией поверхности 3-аминопропилтриалкоксисиланом и затем олигомерным ПЭГ (NHS-dPEG₂₅-COOH), что, в конечном итоге, позволило получить покрытие со значительно большем в сравнении с прототипом содержанием органической фазы (например, содержание углерода в описываемых наночастицах, покрытых ПЭГ - 4.85 масс.%, а в прототипе - до 1.99 масс.%) и бóльшим содержанием в конечном наноконъюгате лекарственного препарата Dox (содержание Dox в описываемом материале - до 28.1 масс.%, а в прототипе - до 16.2 масс.%).

Для характеристики синтезированного наноконъюгата приведены данные об общей структуре композиции, качественном и количественном составе ингредиентов, а также физико-химические характеристики. Все использованные при получении описываемого наноконъюгата реагенты коммерчески доступны.

Авторами проведены необходимые экспериментальные исследования, доказывающие возможность достижения эффективности фармакологического действия водных коллоидных растворов описываемого наноконъюгата.

Способ получения (Схема) наноконъюгата для терапии злокачественных солидных опухолей заключается в том, что используют МНЧ на основе оксида железа (MNPs), полученные, например, методом осаждения из водных растворов солей Fe²⁺и Fe³⁺, взятых в мольном соотношении 1:2 [Demin A.M., Pershina A.G., Minin A.S., Brikunova O.Ya., Murzakaev A.M., Perekucha N.A., Romashchenko A.V., Shevelev O.B., Uimin M.A., Byzov I.V., Malkeyeva D., Kiseleva E., Efimova L.V., Vtorushin S.V., Ogorodova L.M., Krasnov V.P. Smart design of pH-responsive system based on pHLIP-modified magnetite nanoparticles for tumor MRI // ACS Appl. Mater. Interfaces 2021. 13. 36800-36815; Demin A.M., Vakhrushev A.V., Pershina A.G., Valova M.S., Efimova L.V., Syomchina A.A., Uimin M.A., Minin A.S., Levit G.L., Krasnov V.P., Charushin V.N., Magnetic-responsive doxorubicin-containing materials based on Fe₃O₄ nanoparticles with a SiO₂/PEG shell and study of their effects on cancer cell lines // Int. J. Mol. Sci., 2022, 23, 9093]. Оптимальные значения исходной концентрации раствора хлорида трехвалентного железа гексагидрата (FeCl₃×6H₂O, 97%) 5-20 г/л и сульфат двухвалентного железа гептагидрат (FeSO₄×7H₂O, 99%) были 2,5-10 г/л и объемная доля насыщенного водного раствора аммиака в реакционной массе 1:100-1:10; температура до которой необходимо нагревать исходный раствор 25-50°С и продолжительность выдерживания нагретого раствора при достигнутой температуре после добавления насыщенного водного раствора аммиака 10-30 мин были установлены экспериментально.

МНЧ при использовании тетраметилортосиликата (TMOS) или тетраэтоксисилана (TEOS), взятого в мольном соотношении МНЧ (Fe₃O₄):алкоксисилан 1:1,5, покрывают слоем SiO₂, предохраняющим ядро частицы от воздействия на него физиологических сред in vitro и in vivo. Экспериментально продемонстрировано, что использование больших количеств TMOS или TEOS (например, в случае мольного соотношения МНЧ (Fe₃O₄):алкоксисилан 1:3 или 1:5) приводит к образованию агломерированных частиц, те есть многоядерных частиц, объединенных единой оболочкой, которые имеют большие гидродинамические диаметры (>200 нм) и поэтому их коллоидные растворы менее устойчивы. Использование меньших количеств алкоксисилана приводит к образованию частиц с недостаточно развитой поверхностью и соответственно низкой сорбционной емкостью по отношению к сорбируемому препарату (по аналогии с [Demin A.M., Vakhrushev A.V., Valova M.S., Korolyova M.A., Uimin M.A., Minin A.S., Pozdina V.A., Byzov I.V., Tumashov A.A., Chistyakov K.A., Levit G.L., Krasnov V.P., Charushin V.N., Effect of the silica-magnetite nanocomposite coating functionalization on the doxorubicin sorption / desorption // Pharmaceutics 2022, 14, 2271].

Для формирования на поверхности наночастиц аминогрупп с целью создания возможности их дальнейшей ковалентной модификации органическими молекулами, проводят функционализацию (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) или (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES), который берут в количестве 3 ммоль в расчете на 1 г исходных наночастиц, и получают наночастицы MNP-APS. Нами было продемонстрировано, что применение APTMS или APTES для модификации МНЧ на основе Fe₃O₄ дает схожие результаты. Так, использование 2,5 - 3,0 ммоль данных реагентов в расчете на 1 г МНЧ позволяло достигать максимального количества 3-аминопропильных остатков на поверхности МНЧ, которое составляло 0,7 - 1,0 ммоль/г МНЧ. Использование меньших количеств алкоксисилана приводило к получению МНЧ с меньшим содержанием 3-аминопропильных остатков, а использование больших количеств алкоксисилана не приводит к увеличению их содержания на поверхности МНЧ [Demin A.M., Krasnov V.P., Charushin V.N. Covalent modification of surface of Fe₃O₄ magnetic nanoparticles with alkoxy silanes and amino acids // Mendeleev Commun. 2013. 23. 14-16].

Полученные в результате наночастицы MNP-APS используют в качестве платформы для формирования на ней покрытия на основе бифункционального ПЭГ (α-N-сукцинимидный эфир-25(этилен гликоль)-ω-O-3-пропионовая кислота (NHS-dPEG₂₅-COOH)), активированная карбоксильная группа которого позволяет связываться с аминогруппами на поверхности МНЧ за счет образования амидной связи, при этом с другой стороны молекулы ПЭГ остается свободная карбоксильная группа. Acid-dPEG®25-NHS ester брали в массовом соотношении с MNP-APS 1:10 и в результате получали MNP-PEG. Экспериментально продемонстрировано, что соотношение MNP-APS 1:10 является оптимальным. Так, в ходе работы были получены наноконъюгаты при использовании массовых соотношений ПЭГ:MNP-APS 1:2, 1:10 и 1:50. По данным метода динамического рассеяния света они имели гидродинамические диаметры (D_h) (индекс полидисперсности (PdI)) и ζ-потенциал: 91 нм (0,20), -16,6 мВ; 139 нм (0,27),+4,5 мВ; и 118 нм (0,32),+28,9 мВ соответственно, что свидетельствует о несколько лучших гидродинамических характеристиках частиц, полученных с использованием больших количеств ПЭГ. Высокий отрицательный заряд первых частиц обусловлен, вероятно, значительной долей ПЭГ (который имеет отрицательный заряд) в его составе. Положительный заряд последнего типа частиц определяется высокой долей аминогрупп АПС на поверхности. Небольшой положительный поверхностный заряд частиц, полученные при использовании соотношения ПЭГ:MNP-APS 1:10, вероятно, обусловлен небольшим преобладанием аминогрупп АПС над долей ПЭГ. Однако после проведения сорбции на них Dox оказалось, что D_h (PdI) и ζ-потенциал для выше описанного ряда частиц изменились следующим образом: 173 нм (0,21),+4,9 мВ; 126 нм (0,22),+17,2 мВ; и 160 нм (0,31),+27,5 мВ соответственно. Сдвиг ξ-потенциала первых 2-х типов частиц обусловлен сорбцией Dox, который в водных средах имеет положительный заряд. Стоит отметить, что в первом случае происходит, по сути, компенсация отрицательного заряда поверхности частиц, создаваемого ПЭГ, положительным зарядом, обусловленным сорбированным Dox, что должно приводить к ухудшению гидродинамических характеристик и стабильности коллоидного раствора (в данном случае это проявляется лишь в увеличении D_h). Присутствие в составе наноконъюгата значительного количества гидрофильных молекул ПЭГ в целом сохраняет стабильность коллоидного раствора за счет стерической стабилизации. В случае частиц, полученных при использовании соотношения ПЭГ:MNP-APS 1:50, стабильность их коллоидных растворов, вероятно, обусловлена наличием высокого поверхностного заряда частиц (электростатическая стабилизация). В случае частиц, полученных при использовании соотношения ПЭГ:MNP-APS 1:10, небольшой исходный положительный заряд заметно увеличивается, придавая наноконъюгату большую устойчивость. D_h данных частиц наименьший среди изученного ряда, что, вероятно, связано с их стабилизацией благодаря как стерическому, так и электростатическому механизму. Таким образом, лучшими по гидродинамическим параметрам оказались MNP-PEG, полученные при соотношении ПЭГ:MNP-APS 1:10.

На синтезированные MNP-PEG проводили иммобилизацию Dox в фосфатном буфере (рН 7,9) и получали целевой наноконъюгат MNP-PEG*Dox с содержанием Dox 28.1 масс.%.

Возможность удержания Dox в составе свежеполученных MNP-PEG*DOX исследовали диспергированием наноконъюгата в двух буферных растворах с рН 5,8 и 7,4. В результате продемонстрировано, что Dox не выделялся из наноконъюгата MNP-PEG*Dox в растворе с рН 7,4 в течение 24 ч при выдерживании раствора при 37°С. Это свидетельствует о прочном закреплении Dox в составе свежеполученных MNP-PEG*DOX, что фактически исключает десорбцию Dox в здоровых тканях и должно способствовать понижению токсичности описываемого наноконъюгата. Из раствора с рН 5.8 Dox выделялся за первый час инкубации в количестве 4,4 масс.% от загруженного на конъюгат количества Dox, а в последующий период времени, вплоть до 24 ч, дополнительного выделения препарата не зафиксировано. Это свидетельствует о возможности постепенного высвобождения препарата из состава наноконъюгата в средах с пониженным рН, характерным для опухолевых тканей.

Такое рН-опосредованное выделение Dox может привести к избирательной токсичности синтезированного наноконъюгата в отношении опухолевых тканей.

Примеры реализации изобретения

Следующие примеры (1-4) характеризуют способ получения и состав заявляемого наноконъюгата и его водных коллоидных растворов. Также приведены результаты исследования его биологической активности (примеры 5, 6).

Пример 1. Получение наноконъюгата

Синтез исходных МНЧ на основе Fe₃O₄ (MNPs). 60 мл водного раствора FeCl₃×6H₂O (1,401 г, 5,183 ммоль) и FeSO₄×7H₂O (0,720 г, 2,591 ммоль) нагревали на водяной У3-бане до 40°С и быстро добавляли 6 мл насыщенного раствора NH₄OH при перемешивании верхнеприводной мешалкой. Через 10 мин наночастицы осаждали магнитом, промывали 3×20 мл воды. Осадок диспергировали в 60 мл воды, получали коллоидный раствор MNPs 60 мл (10 мг/мл).

Получение МНЧ с SiO₂-покрытием (MNP-SiO₂). К 60 мл водного раствора MNPs (0,600 г, 2,591 ммоль) добавляли 140 мл EtOH и нагревали до 40°С, затем при обработке УЗ на У3-бане и при перемешивании добавляли 20 мл EtOH раствора TEOS (0,870 мл, 3,887 ммоль). После этого добавляли 8.7 мл насыщенного раствора аммиака по каплям в течение 20 мин при обработке УЗ на У3-бане. Перемешивание при 40°С продолжали 4 ч, а затем еще 12 ч при 20°С. Затем МНЧ осаждали центрифугированием (40000 g, 30 мин) и промывали дистиллированной водой (3×60 мл) до нейтрального рН. Осадок диспергировали в 220 мл EtOH 70%, получали коллоидный раствор MNP-SiO₂ (3,82 мг/мл).

Модификации МНЧ 3-аминопропилсиланом (MNP-APS). К 200 мл раствора EtOH 70% MNP-SiO₂ (764 мг) при 40°С и обработке УЗ (20 мин) на У3-бане при перемешивании добавляли раствор 3-аминопропилтриметоксисилана (APTMS) (0,405 мл, 2,306 ммоль) в 10 мл EtOH, после чего в течение 5 мин прикапывали 0,5 мл насыщенного раствора аммиака. Перемешивание при 40°С продолжали 4 ч, а затем еще 16 ч при 20°С. Модифицированные наночастицы осаждали на магните, промывали 2×30 мл CH₃CN и диспергировали в 60 мл CH₃CN. Получали коллоидный раствор MNP-APS (14,26 мг/мл).

Синтез PEG-модифицированных МНЧ (MNP-PEG). К суспензии 0,500 г MNP-APS в 60 мл CH₃CN добавляли раствора 45 мг (0,034 ммоль) PEG (Acid-dPEG®25-NHS ester, Sigma-Aldrich) в 20 мл CH₃CN при перемешивании и обработке на У3-бане 10 мин. Перемешивание продолжали в течение 20 ч (при 20°С). Затем МНЧ осаждали центрифугированием (30000 g, 10 мин), промывали 3×20 мл H₂O и диспергировали в 40 мл H₂O. Получали коллоидный раствор MNP-PEG (14,38 мг/мл).

Иммобилизация DOX на МНЧ (MNP-PEG*DOX). 0,137 г гидрохлорида доксорубицина растворили при 50°C в 135 мл фосфатного буферного раствора (рН=7,8), приготовленного растворением 0,135 г K₂HPO₄×3H₂O в 135 мл H₂O. К полученному раствору добавляли 19 мл коллоидного раствора, содержащего 0,273 г MNP-PEG и перемешивали при 50°C 30 мин, после чего перемешивание продолжали еще 3,5 ч (20°C). Полученные наночастицы осаждали центрифугированием (25000 g, 10 мин) и промывали H₂O 3×15 мл, каждый раз наночастицы осаждали центрифугированием, фугаты анализировали методом флуориметрии для расчета несвязанного с наноконъюгатом Dox как описано ниже. Полученные после трех промывок наночастицы диспергировали в 20 мл H₂O. Получали коллоидный раствор MNP-PEG*DOX (13 мг/мл) с содержанием Dox 28.1 масс.%.

Исследование возможности удержания Dox в составе наноконъюгата MNP-PEG*DOX. Возможность удержания Dox в составе свежеполученных MNP-PEG*DOX исследовали диспергированием наноконъюгата в двух буферных растворах с рН 5,8 и 7,4. Для приготовления фосфатного буферного раствора с рН 5,8 1.19 г Na₂HPO₄×2H₂O и 8,25 г KH₂PO₄×3H₂O растворяли в 1 л воды. Для приготовления фосфатного буферного раствора с рН 7,4 2,38 г Na₂HPO₄×2H₂O и 0,19 г KH₂PO₄×3H₂O растворяли в 1 л воды. Из водного раствора свежеполученных MNP-PEG*DOX (13 мг/мл) отбирали в пробирки по 500 мкл и наночастицы осаждали центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин). Фугат удаляли, а к осадку в пробирке добавляли по 3 мл буферного раствора с рН 5,8 или 7,4 и обрабатывали ультразвуком. Полученные растворы выдерживали в термостате при 37°С.Для определения количества высвободившегося Dox отбирали аликвоты по 500 мкл через 1, 2, 4, 8, 24 ч, центрифугировали (10 мин, 10000 об/мин). В фугатах определяли количество выделившегося Dox методом флуориметрии как описано ниже.

Пример 2. Расчет содержания Dox в MNP-PEG*Dox, а также изучение его высвобождения из наноконъюгата в растворах с разными рН

Количество Dox в наноконъюгате MNP-PEG*Dox рассчитывали косвенным методом - путем определения количества Dox в реакционной массе после удаления из нее наночастиц центрифугированием и фугатах после каждой промывки целевых наночастиц методом флуориметрии, определяя интенсивность флуоресценции образцов при 594 нм.

В результате рассчитывали показатели эффективности сорбции (LE) и уровня загрузки (LC) Dox на наночастицы (выраженные в массовых %) в соответствии с формулами (1) и (2) соответственно.

где m_{Dox load} - это масса (мг) Dox, введенного в реакцию, mⁱ_Dox - это количество (мг) Dox в фугате, полученном после каждой промывки (i - номер промывки MNP-PEG*Dox), m_{nanoconjugate} - это масса (мг) исследуемого нанокоъюгата MNP-PEG*Dox.

Для синтезированного наноконъюгата MNP-PEG*Dox показатель LE составил 82,6%, а LC - 28.1%.

Для оценки количества десорбированного Dox в аликвотах, отобранных из реакционных масс в различные периоды времени (при инкубации наноконъюгата MNP-PEG*Dox в буферных растворах с рН 5.8 и 7.4), использовали также метод флуориметрии. Концентрацию Dox рассчитывали из интенсивности пиков флуоресценции при 594 нм.

Пример 2. Характеристика наноконюгата MNP-PEG*DOX физико-химическими методами

Магнитные наночастицы на основе Fe₃O₄, входящие в состав наноконъюгата, имеют форму, близкую к сферической и средний диаметр по данным ПЭМ 9 нм (полную характеристику исходных наночастиц см. [Demin A.M., Pershina A.G., Minin A.S., Mekhaev A.V., Ivanov V.V., Lezhava S.P., Zakharova A.A., Byzov I.V., Uimin M.A., Krasnov V.P., Ogorodova L.M. PMIDA-modified Fe₃O₄ magnetic nanoparticles: Synthesis and application for liver MRI // Langmuir 2018. 34. 3449-3458]) (Фиг.1). Частицы после нанесения SiO₂/PEG-покрытия и после иммобилизации Dox имели средний диаметр 12,7±2,3 нм и 12,4±2,4 нм соответственно (Фиг.1). Основная фаза ядер полученных наночастиц MNP-PEG и MNP-PEG*Dox согласно данных электронограмм проанализированных образцов соответствует фазе магнетита (на Фиг.1 приведены кристаллографические индексы плоскостей, соответствующих Fe₃O₄).

Удельная намагниченность насыщения для синтезированных наночастиц уменьшалась в ряду MNP-SiO₂, MNP-APS, MNP-PEG и наноконъюгата MNP-PEG*Dox в соответствии с увеличением содержания органической (немагнитной) фазы и составила 55, 53, 50 и 39 A·м²/кг соответственно (Фиг.2).

Данные ИК спектроскопии (Фиг.3) подтверждают наличие в целевых наночастицах ядра на основе оксида железа (полоса колебаний связи Fe-O в области 620 и 575 см^-1) и оболочки на основе оксида кремния (широкая полоса в области 1076-1092 см^-1 и 955-980 см^-1, относящаяся к колебаниям связи Si-O и Si-OH), в этой же области находятся и полосы поглощения, характерные для ПЭГ (валентные асимметричные и симметричные колебания С-О-С). Дополнительно можно отметить наличие полос 1644 и 1535 см^-1, которые могут соответствовать полосам Амид I и Амид II, соответствующих амидной связи, образованной между карбоксильной группой ПЭГ и аминогруппой 3-аминопропилсилана на поверхности наночастиц. В результате иммобилизации Dox в спектрах ИК наноконъюгата MNP-PEG*Dox можно наблюдать заметное смещение характерных для Dox полос поглощения продуктов модификации в сравнении с полосами поглощения Dox при сохранении формы и относительной интенсивности соответствующих полос: 1728 см^-1 (валентные колебания С=O боковой цепи), 1615 см^-1 (валентные колебания С=О антраценового фрагмента), 1578 см^-1 (валентные колебания N-H), что, несомненно, подтверждает иммобилизацию Dox на МНЧ.

Из полученных в результате энергодисперсионного рентгенофлуоресцентного анализа (РФА) данных об относительном содержании Fe и Si в синтезированных материалах (Таблица 1) можно было рассчитать соотношение Fe₃O₄:SiO₂, которое для MNP-SiO₂, MNP-APS, MNP-PEG и наноконъюгата MNP-PEG*Dox составило ~70:30.

Таблица 1. Состав синтезированных МНЧ

МНЧ Данные РФА Данные CHN-элементного анализа Fe₃O₄:SiO₂¹ Количество органических компонентов (ммоль/г)² Fe (%) Si (%) C (%) H (%) N (%) MNP-SiO₂ 77.14 22.86 - - - 69: 31 0 MNP-APS 75.38 24.62 1.89 0.78 0.76 66: 34 0.52 (APS) MNP-PEG 75.67 24.33 4.85 1.14 0.61 67: 33 0.05 (PEG) MNP-PEG*Dox 78.46 21.54 16.49 1.99 0.87 70: 30 0.36 (Dox)

¹ Рассчитано на основе данных РФА; ² Рассчитано на основе данных CHN-элементного анализа.

По данным CHN-элементного анализа, представленным в Таблице 1, можно приблизительно рассчитать количество каждого компонента оболочки наноконюгата.

Для анализа и расчета среднего гидродинамический диаметр и заряда поверхности готовили растворы в деионизованной воде с концентрацией 0,20-0,05 мг MNP/мл. Данные анализа представлены в Таблице 2. Показано, что как наночастицы, модифицированные только ПЭГ (MNP-PEG), так и целевые MNP-PEG*Dox, позволяют получать устойчивые водные коллоидные растворы, используемые для проведения экспериментов in vitro и in vivo (в том числе, для внутриопухолевого введения препаратов в организмы подопытных животных).

Таблица 2. Измерение гидродинамического диаметра (D_h), индекса полидисперсности (PdI) и заряда поверхности (ξ-потенциал) МНЧ модифицированных ПЭГ (MNP-PEG) и их наноконъюгата с Dox (MNP-PEG*Dox)

Образец Дисперсная фаза D_h, нм PdI ζ-потенциал, мВ MNP-PEG вода 86 0,30 +5,7 MNP-PEG*Dox вода 106 0,20 +14,3

Пример 3. Измерение удельного поглощения энергии (SAR)

Измерения скорости поглощения электромагнитной энергии MNP-APS, MNP-PEG и наноконъюгата MNP-PEG*Dox в водном коллоидном растворе выполнены с использованием генератора переменного высокочастотного магнитного поля TOR ULTRA HT («Наноматериалы», Россия). В пробирки типа эппендорф объемом 0.6 мл вносят по 300 мкл коллоидного раствора наночастиц и помещают его в магнитное поле с интенсивностью H=27 мТ, и частотой 230 кГц. Через отверстие в резиновой крышке, плотно закрывающей эппендорф, погружали в суспензию оптоволоконный датчик электронного термометра, с помощью которого измеряли температуру. Далее загрузчик с образцом помещали в прибор. После выравнивания температур образца и прибора (28-30°C) включали генератор переменного магнитного поля. Температуру в образцах фиксировали с интервалом 10 секунд. Динамику нагрева наблюдали в течение 600 с (Фиг.4), для расчета SAR по формуле (3) использовали данные, полученные в течение первых 60 секунд нагрева. Величина SAR для исходных MNP-PEG и MNP-PEG*Dox составила 47,64 и 61,58 Вт/г[Fe] Вт/г соответственно.

где C_H2O -теплоемкость воды 4180 Дж/кг, K;

m_MNP - концентрация наночастиц, г/л;

dT - изменение температуры, К;

dt - интервал времени измерения, сек.

Пример 4. Измерение релаксивности r2 и r1 наноконъюгата MNP-PEG*Dox

Релаксивность r2 и r1 наночастиц MNP-PEG (с концентрациями от 1,172 до 150,0 мкмоль/л) и наноконъюгата MNP-PEG*Dox (с концентрациями от 1,212 до 155,2 мкмоль/л) (Фиг.5), диспергированных в воде, измеряют на релаксометре. T2 вычисляют с использованием импульсной последовательности CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) (90°-TE/2-180-эхо) (4,31 MГц, эхо 1 мс). Для измерения T1 используют импульсную последовательность TRi-90-TE/2-180-эхо (TRi- i-е значение time recovery). Данные о релаксивности получают исходя из функции скорости релаксации от концентрации [Fe]. Наночастицы MNP-PEG и MNP-PEG*Dox имеют релаксивность r2 равную 156 и 90 ммоль^-1 с^-1 соответственно.

Пример 5. Исследование цитотоксичности наноконъюгата MNP-PEG*Dox в отношении опухолевых клеток in vitro

Для изучения цитотоксического действия МНЧ методом МТТ-теста клетки исследуемых линий в 90 мкл ППС рассаживают в лунки 96-луночного планшета: 4T1 - по 4 тыс., MDA-MB231 - по 6 тыс., BJ-5ta - по 5 тыс, HepG2 - по 4,5 тыс.

Планшеты помещают в СО₂-инкубатор на ночь для адгезии клеток. После этого в лунки к клеткам вносят по 10 мкл МНЧ (0,31 - 80 мкг[Fe]/мл) или Dox (0,25 -16 мкМ). В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду, в качестве положительного контроля - 0,1% Triton X-100. Планшеты помещают в CO₂-инкубатор. Жизнеспособность клеток после инкубации с МНЧ оценивают спустя 24, 48 и 72 ч. МТТ-тест проводят по стандартному протоколу [Kumar P., Nagarajan P., Uchil P. Analysis of cell viability by the MTT assay // Cold Spring Harbor Protocols 2018. 6. 469-472]. Для этого по завершении инкубации с тестируемым веществом среду удаляют, лунки отмывают от частиц дважды 1×PBS по 150 мкл. Затем в каждую лунку вносят 100 мкл ППС, содержащей растворенный в 1×PBS МТТ-реагент в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Далее планшеты помещают в термостат: 4T1 и BJ-5ta - на 1 ч, MDA-MB231 и HepG2 - на 2 часа и инкубируют при 37°С.Затем раствор из лунок аккуратно удаляют так, чтобы не захватить кристаллы формазана, и в каждую лунку вносят 200 мкл ДМСО. Кристаллы растворяют на орбитальном шейкере в течение 5 мин при 600 rpm. Оптическую плотность в каждой лунке измеряют на спектрофлуориметре при длине волны 540 нм и опорной длине волны 620 нм.

Жизнеспособность клеток после инкубации с тестируемыми МНЧ или Dox представляют как процент выживших клеток в отношении клеток в лунках отрицательного контроля и рассчитывают по формуле (4):

где ОП_ТО/ПС - усредненная по количеству повторов оптическая плотность лунок с исследуемыми веществами, измеренная при длине волны при длине волны 540 нм и опорной длине волны 620 нм нм;

ОП_к - усредненная по количеству повторов оптическая плотность контрольных лунок, измеренная при длине волны при длине волны 540 нм и опорной длине волны 620 нм.

Также по формуле (5) с применением нелинейного регрессионного анализа рассчитывают IC₅₀.

где Y - оптическая плотность, % от контроля;

Bottom - «нижнее плато», 0%;

Top - «верхнее плато», 100%;

logIC₅₀ - логарифм концентрации полумаксимального ингибирования;

Х - концентрация препарата;

HillSlope - коэффициент наклона кривой.

Результаты исследования цитотоксичности наноконъюгата MNP-PEG*Dox в отношении нормальных и опухолевых клеток in vitro представлены на Фиг.6, результаты расчета IC₅₀ приведены в Таблице 3. При 72-часовой инкубации с Dox нормальные клетки - фибробласты BJ-5ta проявляют большую чувствительность, чем опухолевые клетки. Наноконъюгат в концентрации 80 мкг[Fe]/мл оказывает выраженный цитотоксический эффект на клетки раковых линий, при этом нормальные фибробласты человека BJ-5ta проявляют большую устойчивость к цитотоксическому действию.

Таблица 3. Значения IC₅₀ Dox (мкМ) и нанконъюгата MNP-PEG*Dox (мкг[Fe]/мл) для клеток линий 4T1, MDA-MB231 и BJ-5ta после инкубации в течение 24, 48 и 72 часов, рассчитанные на основании данных МТТ-теста

Линия Dox, мкМ Нанконъюгат MNP-PEG*Dox, мкг[Fe]/мл 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч 4T1 0,94 0,33 0,40 45,14 4,72 4,76 MDA-MB231 18,06 0,84 0,23 101,40 5,64 0,92 BJ-5ta 18,44 1,00 0,19 37,15 234,7 7,27

Пример 6. Использование наноконъюгата MNP-PEG*Dox для терапии опухоли

Исследования выполнены в Сибирском государственном медицинском университете Минздрава России, г.Томск. При проведении исследований животных содержат в стандартных условиях вивария. Содержание и уход за лабораторными животными в виварии осуществляют в соответствии с ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами». Все эксперименты выполняют в соответствии с Правилами ухода и использования лабораторных животных (Guide for the care and use of laboratory animals (Eighth Edition). Washington, D.C.: The National Academies press; 2011. 220 p.). Животных обеспечивают квалифицированным уходом сотрудниками вивария.

Животных содержат по 6 в индивидуально вентилируемых клетках, на стандартной диете при свободном доступе к воде и гранулированному корму для лабораторных грызунов SPF-категории содержания, искусственном фотопериоде 12С:12Т, температуре 22-24°С и влажности 40-50%. В качестве подстилочного материала используют сухие обеспыленные опилки. Корм и подстилку перед использованием автоклавируют при температуре 121°С. Для поения животных используют деионизированную воду, полученную на установке Millipore.

Все болезненные манипуляции и оперативные вмешательства проводят с адекватным обезболиванием (с применением разрешенных препаратов, согласно нормативным регламентирующим документам).

Критериями для гуманной эвтаназии животных являлось:

- окончание эксперимента, но не более 90 дней;

- достижение опухолью объема 1000 мм³;

- быстрая потеря веса животным (>20% от нормального веса тела).

Все эксперименты выполняют в соответствии с протоколом, одобренным комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных (IACUC).

Для исследования использовали самок мышей линии BALB/c в возрасте 6-8 недель весом 18-20 г; животные получены из ЦКП «Центр генетических ресурсов лабораторных животных «SPF-виварий» Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (ИЦиГ СО РАН).

Для воспроизведения модели опухолевого роста 10⁶ клеток линии 4Т1 карциномы молочной железы в 50 мкл 1×PBS перевивают мышам подкожно в правую нижнюю молочную железу.

Для введения животным готовят суспензию наноконъюгата в 1×PBS с концентрацией 3 мг/мл. Перед введением суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течение 30 секунд. Введение наноконъюгата животным и последующие манипуляции осуществляют под общим газовым наркозом изофлураном R540IE (RWD Life Science, Китай). Наноконъюгат вводят мышам внутриопухолево. Внутриопухолевое введение проводят c использованием столика для фиксации малых лабораторных животных с ИК-подогреваемой подложкой. Для введения используют индивидуальные шприцы на 1 мл с иглой 30G. Иглу вводят в центр опухоли и вводят 50 или 100 мкл суспензии небольшими нажатиями на поршень со скоростью 20 мкл/минуту.

Для воздействия переменным магнитным полем животное помещают кроватку прибора для магнитной гипертермии TOR Ultra HT (Наноматериалы, Россия), которую размещают в магнитной катушке прибора, генерирующего магнитное поле. Температура в водном контуре катушки поддерживается в течение всего эксперимента на уровне 30°С.

Для оценки противоопухолевого действия измерение размеров опухоли проводят два раза в неделю с использованием штангенциркуля. Первое измерение проводят на 6-е сутки после трансплантации опухоли. Массу тела животных регистрируют еженедельно.

Объем опухоли (V) рассчитывают по формуле (6):

где l - длина опухолевого узла, мм;

w - ширина опухолевого узла, мм.

Показатель торможения роста опухоли (ТРО) рассчитывают по формуле (7):

где V_{контроль} - средний объем опухолевого узла (мм³) у животных в контрольной группе;

V_опыт - средний объем опухолевого узла (мм³) у животных в опытной группе.

Эвтаназию животных проводят путем введения животного в глубокую анестезию ингаляционным наркозом препаратом Изофлуран с помощью аппарата для анестезии мелких лабораторных животных.

У животных извлекают опухоль и органы (печень, легкие, селезенка, почки, сердце), которые предварительно осматривают на предмет метастазов. Далее органы и опухоль взвешивают. Образцы опухоли и легких помещают в 10% нейтральный формалин для фиксации, последующей заливки в парафиновые блоки и приготовления гистологических срезов.

Морфологическому исследованию подвергают ткань легких и опухолевую ткань. Фиксацию ткани опухоли проводят в 10% pH-нейтральном растворе формалина. Объем фиксирующей жидкости должен превышать объем фиксируемой ткани минимум в 5 раз. Общая продолжительность фиксации материала - не более 24 часов при комнатной температуре.

Для получения гистологических препаратов проводку тканевых образов осущетсвляют стандартным способом в автоматическом гистопроцессоре с использованием раствора для гистологической обработки. Заливку образцов проводят в парафин. С парафиновых блоков готовят серийные срезы толщиной 3-4 мкм с помощью санного микротома HM 430. Гистологическое исследование опухоли проводят в полном объеме, с приготовлением гистологических срезов по максимальному диаметру опухолевого узла. Гистологические срезы изготавливают на разной толщине среза опухоли.

Для окрашивания микропрепаратов с целью выявления железа в ткани используют коммерческий набор красителей для окрашивания по методу Перлса. Гистологическое исследование проводят с помощью биологического микроскопа.

При проведении иммуногистохимического исследования используют моно- и поликлональные антитела Anti-Ki67 antibody (ab15580, Abcam), Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E), Goat anti-Rabbit IgG (H+L) G-21234 (Thermo Fisher). Демаскировку тканевых образцов проводят в 10 мМ цитратном буфере (pH 6,0) при 98°С в течение 30 минут.Для детектирования окрашивания используют набор реагентов DAB Substrate Kit. Исследование проводят с помощью биологического микроскопа.

Оценку пролиферативной активности проводят по ядерному окрашиванию опухолевых клеток с антителом к Ki67. Оценивают 10 полей зрения опухоли при увеличении микроскопа ×200. При наличии «горячих точек» (hot-points) их подсчет обязательно включается в общий результат.Кроме этого, оценивают тип распределения делящихся клеток (диффузный или краевой). Интенсивность ядерного иммунного окрашивания не учитывается. Подсчет результатов иммунного окрашивания проводят с помощью машинного метода, используют набор стандартных плагинов программы с открытым доступом FIJI (ImageJ).

Расчет индекса пролиферации осуществляют по формуле (8):

Оценку индукции апоптоза проводят по цитоплазматическому окрашиванию опухолевых клеток с антителом Cleaved Caspase-3. Срезы опухолей полностью сканируют при увеличении микроскопа ×200. Затем рассчитывают площадь позитивных клеток с помощью машинного метода, используют набор стандартных плагинов программы с открытым доступом ImageJ.

Обработку экспериментальных данных проводят с использованием программных пакетов GraphPad Prism7 и Microsoft Office Excel. Для всех данных применяют описательную статистику. На нормальность распределения данные проверяют с использованием теста Шапиро-Уилкса. Данные, подчиняющиеся нормальному распределению представляют как среднее±стандартное отклонение (M±SD). Статистическую значимость различий определяют, используя t-тест Стьюдента. Для выявления достоверности различий в случае множественных сравнений используют однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) для группового сравнения, затем критерий Даннета для попарных сравнений с контрольной группой или критерий Тьюки для попарных сравнений групповых средних. Для анализа выживаемости Каплана-Мейера применяют критерий логарифмического ранга (Мантела-Кокса). Достоверность различий считали значимой при p < 0,05.

В результате изучения противоопухолевой активности наноконъюгата MNP-PEG*Dox, установлено, что его 3х кратное внутриопухолевое введение в дозе 0,3 мг на опухоль в сочетании с магнитной гипертермией через 24 часа после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут приводит к торможению опухолевого роста на 22% (Таблица 4). Согласно данным иммуногистохимического анализа опухолей с использованием специфических антител, внутриопухолевое введение наноконъюгата MNP-PEG*Dox в сочетании с воздействием магнитного поля (ПМП) при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут через 24 часа после введения, приводит к снижению пролиферативной активности клеток в опухоли (Фигура 7) и усилению апоптоза по сравнению с контрольной группой животных без лечения (Фигура 8).

Таблица 4. Индекс торможения роста опухоли 4Т1 в экспериментальных группах животных

Группа, количество животных Степень торможения роста опухоли, ТРО%
(указаны сутки после трансплантации опухоли) 8-е 12-е 15-е 18-е 21-е 25-е 28-е PBS+ПМП 33 8 18 -9 13 10 6 MNP-PEG 28 26 55 20 34 31 17 MNP-PEG+ПМП 50 10 32 14 22 22 22 MNP-PEG*Dox 23 15 10 19 21 25 28 MNP-PEG*Dox+ПМП 12 -6 32 27 18 20 22 Dox+ПМП 46 31 49 49 51 50 30

Примечание: PBS+ПМП - группа животных с внутриопухолевым введением 1×PBS на 5-е, 12-е и 18-е сутки после трансплантации опухоли 4Т1 и магнитной гипертермией через 24 после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут; MNP-PEG - группа животных с внутриопухолевым введением наночастиц MNP-PEG (без Dox) на 5-е, 12-е и 18-е сутки после трансплантации опухоли 4Т1; MNP-PEG+ПМП - группа животных с внутриопухолевым введением наночастиц MNP-PEG (без Dox) на 5-е, 12-е и 18-е сутки после трансплантации опухоли 4Т1 и магнитной гипертермией через 24 после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут; MNP-PEG*Dox - группа животных с внутриопухолевым введением наноконъюгата MNP-PEG*Dox на 5-е, 12-е и 18-е сутки после трансплантации опухоли 4Т1; MNP-PEG*Dox+ПМП - группа животных с внутриопухолевым введением наноконъюата MNP-PEG*Dox на 5-е, 12-е и 18-е сутки после трансплантации опухоли 4Т1 и магнитной гипертермией через 24 после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут; Dox+ПМП - группа животных с внутриопухолевым введением Dox на 5-е, 12-е и 18-е сутки после трансплантации опухоли 4Т1 и магнитной гипертермией через 24 после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут.

Анализ антиметастического действия наноконъюгата показал, что в легких животных контрольной группы и группы с 3х кратным введением Dox обнаруживали многочисленные метастазы, серовато-белого цвета, сливающиеся между собой, структура легких была изменена. В группе животных с 3х кратным внутриопухолевым введением наноконъюгата MNP-PEG*Dox и последующей магнитной гипертермией через 24 часов после каждого введения при осмотре легких выявляли единичные метастазы округлой формы с четкими границами, серовато-белого цвета, у многих животных легкие сохраняли свою структуру при макроскопическом изучении (Фигура 9).

Таким образом, впервые получен наноконъюгат, содержащий магнитную наночастицу на основе оксида железа, покрытую SiO₂-оболочкой, ковалентно модифицированную ПЭГ, и содержащую сорбированный на поверхности противоопухолевый препарат доксорубицин, обеспечивающий возможность проведения химиотерапии солидных опухолей. Водные коллоидные растворы предложенного наноконъюгата использованы для лечения злокачественных солидных опухолей in vivo и могут быть применены для терапии опухолей за счет комбинирования эффекта локальной гипертермии (из-за способности наноконъюгата разогреваться в переменном магнитном поле) и химиотерапии (химического действия Dox). Так, в результате изучения противоопухолевой активности наноконъюгата MNP-PEG*Dox, установлено, что его 3х кратное внутриопухолевое введение в дозе 0,3 мг на опухоль в сочетании с магнитной гипертермией через 24 часа после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут приводит к торможению опухолевого роста на 22%, а анализ антиметастического действия наноконъюгата MNP-PEG*Dox показал, что в аналогичной группе животных, подвергшихся терапии по той же схеме при осмотре легких выявляли единичные метастазы в отличие от контрольной группы животных и группы животных с 3х кратным введением Dox, в которых наблюдали многочисленные метастазы и в грудной, и в брюшной полостях. Наличие у водных коллоидных растворов наноконъюгата высоких значений релаксивности r2 позволяет предполагать возможность мониторинга его распределения с целью оценки точного его накопления в тканях опухоли методом МРТ, что может позволить увеличить эффективность применения данного материала в терапии.

Краткое описание чертежей

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:

Фигура 1. Изображения ПЭМ (А) наночастиц модифицированных ПЭГ (MNP-PEG) и (Б) распределение частиц MNP-PEG по размерам, а также (В) наноконъюгата, содержащего Dox (MNP-PEG*Dox), и (Г) распределение частиц MNP-PEG*Dox по размерам. Электронограммы наночастиц (Д) MNP-PEG и (Е) MNP-PEG*Dox (в скобках приведены кристаллографические индексы плоскостей, соответствующих Fe₃O₄).

Фигура 2. Кривые намагниченности для исходных МНЧ (MNPs), наночастиц с SiO₂-покрытием (MNP-SiO₂), наночастиц модифицированных (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) - MNP-APS, наночастиц модифицированных ПЭГ - MNP-PEG и наноконъюгата, содержащего Dox (MNP-PEG*Dox).

Фигура 3. Спектры НПВО наночастиц модифицированных (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) - MNP-APS, наночастиц модифицированных ПЭГ - MNP-PEG, наноконъюгата, содержащего Dox (MNP-PEG*Dox).

Фигура 4. Начальный линейный участок кривых нагрева водных суспензий МНЧ, модифицированных (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) - MNP-APS, наночастиц модифицированных Acid-dPEG®25-NHS ester (PEG) - MNP-PEG и наноконъюгата, содержащего Dox, MNP-PEG*Dox с концентрацией 10 мг[Fe]/мл при частоте переменного магнитного поля 230 кГц и магнитной индукции 27 мТл (соответствует напряженности магнитного поля 21,5 кА/м). Данные представлены как среднее±SD, n=3.

Фигура 5. Зависимость скорости релаксации (обратно пропорциональной времени релаксации протонов Т1 и Т2) (а) для наночастиц модифицированных Acid-dPEG®25-NHS ester (MNP-PEG) и наноконъюгата MNP-PEG*Dox от концентрации наночастиц (пересчитанной на концентрацию [Fe], ммоль/л) в водных коллоидных растворах.

Фигура 6. Жизнеспособность клеток линий (А) 4T1, (Б) MDA-MB231, (В) BJ-5ta после инкубации с наноконъюгатом MNP-PEG*Dox в течение 24, 48 и 72 часов. Данные представлены как M±SD (N=2, n=6). Примечание: * - достоверность отличий от контроля, # @ - достоверность отличий от инкубации в течение 24 ч, # - достоверность отличий от инкубации в течение 48 ч p<0,05.

Фигура 7. Влияние внутриопухолевого введения наноконъюгата MNP-PEG*Dox на пролиферацию клеток в опухоли. Репрезентативные фотографии срезов опухолей 4Т1, извлеченных из (А) животных контрольной группы без введения наноконъюгата MNP-PEG*Dox (Контроль); (Б) животных с однократным внутриопухолевым введением наночастиц MNP-PEG (без Dox) и магнитной гипертермией, индуцированной переменным магнитным полем (ПМП), через 24 часа после введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут (MNP-PEG+ПМП); (В) животных с однократным внутриопухолевым введением наноконъюгата MNP-PEG*Dox и магнитной гипертермией через 24 часа после введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут (MNP-PEG*Dox+ПМП). Срезы окрашены антителами к Ki67 (иммуногистохимическое окрашивание с 3,3′-испльзованием диаминобензидина (ДАБ). (Г) Индекс пролиферативной активности (ИП) клеток в опухолях 4Т1, извлеченных из животных без введения (Контроль), животных с внутриопухолевым введением наночастиц MNP-PEG в сочетании с магнитной гипертермией через 24 часа после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут (MNP-PEG+ПМП) или животных с внутриопухолевым введением наноконъюгата MNP-PEG*Dox в сочетании с магнитной гипертермией через 24 часа после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут (MNP-PEG*Dox+ПМП). Данные представлены как M±SD, n=3. * p<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Фигура 8. Влияние внутриопухолевого введения наноконъюгата MNP-PEG*Dox на апоптоз клеток в опухоли. Репрезентативные фотографии срезов опухолей 4Т1, извлеченных из (А) животных контрольной группы без введения наночастиц; (Б) животных с однократным внутриопухолевым введением MNP-PEG (без Dox) и магнитной гипертермией через 24 часа после введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут; (В) животных с однократным внутриопухолевым введением MNP-PEG*Dox и магнитной гипертермией через 24 часа после введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут.Срезы окрашены антителами к Cleaved Caspase-3 (иммуногистохимическое окрашивание с 3,3′-испльзованием диаминобензидина (ДАБ). (Г) Относительная площадь иммунопозитивных Caspase-3⁺областей в опухолях 4Т1, извлеченных из животных без введения (Контроль), животных с внутриопухолевым введением наночастиц MNP-PEG в сочетании с магнитной гипертермией через 24 часа после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут (MNP-PEG+ПМП) или животных с внутриопухолевым введением наноконъюгата MNP-PEG*Dox в сочетании с магнитной гипертермией через 24 часа после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут (MNP-PEG*Dox+ПМП). Данные представлены как M±SD, n=3. * p<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Фигура 9. Влияние 3х кратного внутриопухолевого введения наноконъюгата MNP-PEG*Dox с последующей магнитной гипертермией на метастазирование в легкие. Репрезентативные фотографии ткани легких, извлеченных из (А) животных контрольной группы без манипуляций, (Б) животных с 3х кратным внутриопухолевым введением раствора доксорубицина и (В) животных с 3х кратным внутриопухолевым введением наноконъюгата и магнитной гипертермией через 24 часа после введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут.Окраска гематоксилин-эозин. Стрелками указаны метастазы. (Г) Гистограммы распределения значений степени распространения метастазов в легких животных без введения (Контроль), животных с 3х кратным внутриопухолевым введением Dox и животных с 3х кратным внутриопухолевым введением наноконъюгата MNP-PEG*Dox в сочетании с магнитной гипертермией через 24 часа после каждого введения при 27 мТл, 230 кГц в течение 60 минут (MNP-PEG*Dox).

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к наноконъюгату для терапии злокачественных солидных опухолей и способу его получения. Наноконъюгат включает наноразмерную частицу оксида железа и противоопухолевый препарат доксорубицин, при этом наноразмерная магнитная частица оксида железа Fe_nFe_3-nO₄, где 0 ≤ n ≤ 1, покрыта слоем SiO₂, функционализированным 3-аминопропилсиланом, ковалентно связанным с SiO₂ и молекулами бифункционального полиэтиленгликоля с молярной массой от 1000 до 10000 Да с концевыми карбоксильными группами. Способ получения наноконъюгата заключается в нанесении на наноразмерную магнитную частицу оксида железа Fe_nFe_3-nO₄, где 0 ≤ n ≤ 1, слоя SiO₂ при использовании тетраметилортосиликата (TMOS) или тетраэтоксисилана (TEOS), его модификации (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) или (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES), последующем ковалентном связывании с молекулами бифункционального полиэтиленгликоля с молярной массой от 1000 до 10000 Да с концевыми карбоксильными группами за счет образования амидной связи и закреплении на поверхности противоопухолевого препарата доксорубицина. Предлагаемый наноконъюгат позволяет проводить терапию злокачественных солидных опухолей за счет комбинирования эффекта локальной гипертермии (при применении переменного магнитного поля) и химиотерапии (за счет наличия в составе наноконъюгата противоопухолевого препарата). Имеется также возможность проводить мониторинг его распределения в опухоли методом МРТ. 2 н.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 6 пр.

1. Наноконъюгат для терапии злокачественных солидных опухолей, включающий наноразмерную частицу оксида железа, содержащий в своём составе противоопухолевый препарат доксорубицин, отличающийся тем, что наноразмерная магнитная частица оксида железа Fe_nFe_3-nO₄, где 0 ≤ n ≤ 1, покрыта слоем SiO₂, функционализированным 3-аминопропилсиланом, ковалентно связанным с SiO₂ и молекулами бифункционального полиэтиленгликоля с молярной массой от 1000 до 10000 Да с концевыми карбоксильными группами.

2. Способ получения наноконъюгата п. 1, заключающийся в нанесении на наноразмерную магнитную частицу оксида железа Fe_nFe_3-nO₄, где 0 ≤ n ≤ 1 слоя SiO₂ при использовании тетраметилортосиликата (TMOS) или тетраэтоксисилана (TEOS), его модификации (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) или (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES), последующем ковалентном связывании с молекулами бифункционального полиэтиленгликоля с молярной массой от 1000 до 10000 Да с концевыми карбоксильными группами за счет образования амидной связи и закреплении на поверхности противоопухолевого препарата доксорубицина.