СПОСОБ ОЧИСТКИ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК C07K14/00 C07K14/47 A61K38/17 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства лекарственных препаратов и диагностикумов на основе альфа-фетопротеина (АФП) человека.

Известен способ очистки альфа-фетопротеина человека с помощью последовательного применения хроматографии на Affi-Gel Blue c иммобилизированным красителем "цибокрон голубой F3GA" и иммуноаффинной хроматографии на Сефарозе с иммобилизованной антисывороткой против АФП [1] Недостатком способа [1] является низкая производительность и необходимость использования денатурирующих условий для элюции альфа-фетопротеина с иммуноаффинной колонки.

Известен также способ очистки АФП, включающий предварительную очистку с помощью ионообменной хроматографии и последующую окончательную очистку с помощью иммуноаффинной хроматографии [2]-прототип.

Недостатками способа [2] являются длительность и трудоемкость процесса выделения, низкая производительность и необходимость использования денатурирующих условий для элюции целевого продукта с иммуноаффинной колонки.

Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса очистки АФП, повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе очистки альфа-фетопротеина человека, включающем предварительную очистку исходного сырья с помощью ионообменной хроматографии сыворотки крови, содержащей альфа-фетопротеин(АФП), и последующую иммуноаффинную хроматографию на сорбенте с иммобилизованными антителами к АФП, согласно изобретению предварительную очистку исходного сырья проводят в один этап на диэтиламиноэтил (ДЕАЕ)-ионообменной колонке при рН 6,2-6,4 методом ступенчатой концентрационной элюции, при этом исходное сырье перед нанесением на ДЕАЕ-ионообменную колонку разводят стартовым буферным раствором, сорбент для иммуноаффинной хроматографии приготавливают из аффинноочищенных поликлональных моноспецифических антител против АФП человека, элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислотой, полученную фракцию АФП дополнительно очищают аффинной хроматографией на колонках с антителами против белков нормальной сыворотки крови человека и анти-АФП-антител и гельфильтрацией.

При проведении предварительной очистки исходного сырья в один этап на ДЕАЕ-ионообменной колонке при рН 6,2-6,4 методом ступенчатой концентрационной элюции АФП сорбируется на ионнообменнике, в то время как 95-97% балластных белков выходят с колонки, не связываясь с ней. Это позволяет наносить на 1 объем ионообменного геля от 0,2 до 1 объема сырья без снижения эффективности очистки.

Разведение исходного сырья перед нанесением на ДЕАЕ-ионообменную колонку стартовым буферным раствором вместо используемого в прототипе диализа позволяет уменьшить величины рН и концентрации солей.

Изготовление иммуноаффинного сорбента на основе аффинно очищенных поликлональных моноспецифических антител против АФП человека позволяет изготовить аффинную колонку с высокой удельной емкостью.

Использование ступенчатого градиента элюции белка вместо более трудоемкого и длительного непрерывного градиента элюции совместно с выбором типа ионообменника,условий его работы, способа нанесения исходного сырья и снятия частично очищенного АФП позволяют почти на порядок повысить эффективность предварительной очистки.

Дополнительная очистка полученной фракции АФП аффинной хроматографией на колонках с антителами против белков нормальной сыворотки крови человека и анти-АФП-антител и гельфильтрация позволяет отделить основной продукт от димерных форм АФП.

Способ позволяет создать промышленную технологию получения АФП человека высокой чистоты.

Способ очистки альфа-фетопротеина человека реализуется следующим образом.

Сначала осуществляют предварительную очистку исходного сырья сыворотки крови, содержащую альфа-протеин АФП, в качестве которого может быть использована абортивная сыворотка, пуповинная сыворотка околоплодная жидкость и др. Исходное сырье разводят стартовым буферным раствором и затем наносят на диэтилоаминоэтил (ДЕАЕ)-ионообменную колонку при рН 6,2-6,4. После нанесения исходного сырья колонку промывают стартовым буферным раствором.

Полученную фракцию АФП наносят на иммуноаффинную колонку. Элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислоты, при этом для приготовления сорбента для иммуноаффинной хромотографии используют очищенные поликлональные моноспецифические антитела АФП человека.

Далее очищают выделенный АФП от возможных следовых количеств белков сыворотки или фрагментов иммуноглобулинов аффинной хроматографией на колонках с антителами против белков нормальной сыворотки крови человека и анти-АФП-антител и гельфильтрацией.

Способ иллюстрируется примерами.

П р и м е р 1. К 800 мл абортивной сыворотки с концентрацией АФП приблизительно 270 мгк/мл (общее количество АФП приблизительно 220 мг) добавили 1600 мл 0,04 М калий фосфатного буфера, рН 6,2 и нанесли на колонку, содержащую 4 литра ДЕАЕ-Сефарозы. Скорость нанесения сырья составляла 900 мл/ч.

После нанесения сыворотки колонку промывали 4 литрами 0,04 М калий-фосфатного буферного раствора, рН 6,2, содержащего 0,05 М хлористого натрия. Сорбировавшийся на колонке белок снимали 0,04 М калий-фосфатным буферным раствором, содержащим 0,2 М хлористого натрия. После начала нанесения снимающего буферного раствора 2 литра выходящего из колонки буфера отбрасывали, а следующие 4 литра, содержащие альфа-фетопротеин, собирали. Затем колонку уравновешивали 5 литрами 0,04 М калий-фосфатного буфера, рН 6,2.

Фракцию, содержащую АФП, концентрировали до объема 150 мл и добавляли в нее концентрированный раствор Трис-НСl рН 8,0 до конечной концентрации 0,05 М и концентрированный раствор хлористого натрия до конечной концентрации 0,5 М. Затем эту фракцию наносили на иммуноаффинную колонку 2,6х60 см с ковалентно связанными с ВrCN-активированной Сефарозой Сl-4B очищенными на иммуноаффинном сорбенте моноспецифическими поликлональными антителами кролика против АФП человека. Перед нанесением колонку промывали сначала 0,01 М раствором НСl, затем уравновешивали буферным раствором 0,05 Трис-НСl, рЕ 8,0. Скорость нанесения составляла 400 мл/ч.

После нанесения содержащей АФП фракции колонку промывали стартовым буфером до тех пор, пока оптическая плотность выходящего из колонки раствора не снижалась до 0,005 оптических единиц. Затем АФП снимали, пропуская через колонку 0,01 М раствор НСl. Профиль элюции контролировалиспектрофотометрически, по поглощению в 280 нм. Практически весь белок сходил с колонки в интервале рН от 6 до 5. Сразу после снятия белка с колонки, рН раствора поднимали до 8, добавляя концентрированный Трис-НСl буфер. Объем снятой с аффинной колонки фракции АФП составлял около 100 мл, концентрация приблизительно 1 мг/мл.

Для того, чтобы очистить выделенный АФП от возможных следовых количеств белков сыворотки или фрагментов иммуноглобулинов кролика, которые могли быть внесены на стадии аффинной хроматографии полученная фракция наносилась последовательно на аффинную колонку с антителами кролика.

Для того, чтобы перевести альфа-фетопротеин в низкомолекулярный буферный раствор и одновременно отделиться от возможных мономерных или деградированных форм АФП, полученный после аффинной хроматографии, белок концентрировали на концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до объема 5 мл и наносили на гельхроматографическую колонку с биогелем АсА-34, уравновешенную 0,005 М Na-фосфатным буферным раствором, рН 7,5. Сразу после стадии гельхроматографии белок был сконцентрирован в концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до конечной концентрации 45 мг/мл и лиофильно высушен. Общее количество выделенного АФП составило 98 мг (выход продукта 45%). Все операции проводили при 4-8^oC.

П р и м е р 2. К 4 мл абортивной сыворотки с концентрации АФП 83 мкг/мл (общее количество АФП приблизительно 332 мг) добавили 8 л 0,04 М калий-фосфатного буфера, рН 6,2 и нанесли на колонку, содержащую 4 л ДЕАЕ-Сефаразы. Скорость нанесения сырья составляла 900 мл/ч. Дальнейшие действия в точности соответствуют действиям в примере 1. Общее количество выделенного АФП составило 126 мг (выход продукта 38%).

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: способ очистки альфа-фетопротеина, который заключается в том, что исходное сырье (сыворотка крови) предварительно разводят буферным раствором, подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ионообменной колонке при рН 6,2-6,4 и иммуноаффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизационными антителами к АФП, в качестве которых использованы аффинно очищенные поликлональные моноспецифические антитела к АФП, причем элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислоты, а полученную фракцию АФП дополнительно очищают аффинной хроматографией на колонках с сорбентом на основе антител к белкам нормальной сыворотки крови человека и сорбентом, содержащим иммуноглобулины кролика к АФП человека, с последующей гельфильтрацией, концентрированием и лиофильным высушиванием целевого продукта. Способ позволяет получать препарат высокой степени очистки.

Способ очистки альфа-фетопротеина человека, включающий предварительную очистку исходного сырья сыворотки крови, содержащей альфа-фетопротеин, с помощью ионообменной хроматографии и последующую иммуноаффинную хроматографию на сорбенте с иммобилизованными антителами к АФП, отличающийся тем, что исходную сыворотку предварительно разводят стартовым буферным раствором, ионообменную хроматографию проводят на ДЭАЭ ионообменной колонке при pH 6,2 - 6,4 с использованием ступенчатой концентрационной элюции, для иммуноаффинной хроматографии используют сорбент на основе аффинно-очищенных поликлональных моноспецифических антител к АФП человека, причем элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислоты, полученную фракцию АФП дополнительно очищают аффинной хроматографией на колонках с сорбентом на основе антител к белкам нормальной сыворотки крови человека и сорбентом, содержащим иммуноглобулины кролика к АФП человека, с последующей гельфильтрацией, концентрированием и лиофильным высушиванием целевого продукта.