СПОСОБ ОСВЕТЛЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N9/56 

Настоящее изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности, конкретно к новому способу повышения белизны ферментного препарата щелочной протеазы, применяемой в качестве биологически активной добавки к синтетическим моющим средствам (СМС) для удаления со стираемых текстильных изделий из натуральных и химических волокон белковых загрязнений.

В отечественной промышленности для осветления щелочной протеазы, получаемой при глубинном культивировании Bacillus subtilis штамм 72, с последующей очисткой, сепарацией, стандартизацией, сушкой и гранулированием, применяют двуокись титана в количестве до 10,5% от массы сухой протеазы в зависимости от ее исходной белизны. Недостатком этого способа является применение значительного количества дефицитной и дорогой двуокиси титана, используемой только в качестве инертного наполнителя белого цвета, которая выбрасывается без утилизации при использовании СМС [1]
Известен способ осветления протеазы, используемой в качестве биодобавки к СМС, химическим восстановителем ронгалитом (гидроксиметансульфинатом натрия). Осветление проводят путем обработки готового ферментативного раствора, предпочтительно после очистной фильтрации, ронгалитом, взятом в количестве до 5% от протеазы, в течение до 24 часов, при определенной температуре и pH среды (значения последних параметров в патенте [2] не указаны). Достигаемый показатель белизны (коэффициент отражения Y) 49,5% (по прибору RFC 3 Цейсс).

К недостаткам этого способа относятся необходимость введения дополнительной стадии химического осветления протеазы в водном растворе, применение значительного количества дефицитного и дорогого восстановителя и продолжительное время осветления.

Задача изобретения упрощение способа осветления щелочной протеазы.

По техническим требованиям производителей СМС (ТУ 64-13-19-89), предъявляемым к протеазе, показатель белизны (коэффициент отражения Y) должен быть не ниже 50% по лейкометру Цейсс с зеленым светофильтром, а протеолитическая активность не менее 50000±2500 ед/г.

Поставленная задача достигается путем введения в состав щелочной протеазы в незначительных количествах (0,1 0,4%) флуоресцирующих в синей области спектра (400 500 нм) органических соединений, относящихся к производным 4,4'-бис(триазиниламино)стильбен-2,2'-дисульфокислоты I, кумарина II, 5,6-бензокумарина III, 1,3-дифенилпиразолина IV и бензоксазола V [3]

Осветляющее действие этих флуоресцентных органических соединений основано на том, что излучаемый ими синий или фиолетовый свет под действием ультрафиолетовых лучей дневного света компенсирует недостаток синих и фиолетовых лучей в отражаемом материалом свете, благодаря чему уменьшается желтизна и повышается его белизна.

По предложенному способу в расплав полиэтиленгликоля (ПЭГ-115) при 60 - 70^oC вводят флуоресцентной осветлитель типа I VI, неосветленную щелочную протеазу после сушки на распылительной сушилке и безводный сульфат натрия в дозировках и режиме по действующей технологии и размешивают до получения однородной массы. Последнюю гранулируют путем экструзии. По этому новому способу осветления изменять параметры технологического режима и аппаратурное оформление промышленного производства протеазы не требуется.

При применении указанных флуоресцентных осветлителей в количестве от 0,1 до 0,4% от массы протеазы коэффициент отражения последней повышается до 50,2
54,2% (такой же коэффициент получается при прибавлении 10,5% двуокиси титана). Коэффициент отражения образца протеазы, полученной в этих же условиях ( с сульфатом натрия) без применения флуоресцентного осветлителя и двуокиси титана, составил 43,6% а исходной протеазы 41,0%
Протеолитическая активность протеазы, осветленная флуоресцентными соединениями, полностью сохраняется.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В стеклянный стаканчик вместимостью 100 см³, помещенный в водяную баню для нагрева и снабженный термометром, загружают 2,5 г (25%) полиэтиленгликоля (ПЭГ-115) и расплавляют его при 60 70^oС. Затем вносят в расплав при размешивании стеклянной палочкой 0,005 0,02 г (0,1 0,4% от массы протеазы) флуоресцентного осветлителя типа I и продолжают размешивание 5 10 минут до достижения равномерного распределения осветлителя в расплаве полиэтиленгликоля. Затем загружают за 5 мин при размешивании 5 г (50%) неосветленной щелочной протеазы с показателем белизны (коэффициентом отражения) 41% размешивают при 60 70^oC в течение 10 15 мин, добавляют 2,5 г (25%) сульфата натрия и размешивают до получения однородной массы.

При этом достигается равномерное голубое свечение протеазы при облучении ультрафиолетовым светом. Полученную смесь переносят в фарфоровую ступку, охлаждают, измельчают, просеивают через сито N 04 по ГОСТ 6613-86 и определяют коэффициент отражения на лейкометре Цейсс с зеленым светофильтром в соответствии с ТУ 64-13-19-89 на "Препарат ферментный щелочная протеаза".

Коэффициент отражения протеазы, осветленной посредством флуоресцентного осветлителя 1, составил 51,2 52,9% а протеолитическая активность 53500 ед/г.

Протеаза, обработанная вышеуказанным способом без добавления осветлителя 1 и двуокиси титана, имела коэффициент отражения 43,6%
Пример 2.

5 г протеазы осветляют путем добавки 0,005-0,015 г (0,1 0,3%) флуоресцентного осветлителя типа II по способу, описанному в примере 1. Получают продукт с коэффициентом отражения 50,3 -51,8% протеолитическая активность на уровне технических требований.

Пример 3.

5 г протеазы осветляют путем добавки 0,005 -0,02 г (0,1 0,4%) осветлителя типа III по способу, описанному в примере 1. Получают продукт с коэффициентом отражения 52,2 54,2% протеолитическая активность на уровне технических требований.

Пример 4.

5 г протеазы осветляют путем добавки 0,005 -0,01 г (0,1 -02%) осветлителя IV по способу, описанному в примере 1. Получают продукт с коэффициентом отражения 50,2 52,1% протеолитическая активность на уровне технических требований.

Пример 5.

5 г протеазы осветляют путем добавки 0,005 -0,01 г (0,1 0,2%) осветлителя типа V по способу, описанному в примере 1. Получают продукт с коэффициентом отражения 50,3 51,1% протеолитическая активность на уровне технических требований.

Таким образом, как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ осветления щелочной протеазы позволяет упростить этот процесс и расширить сырьевую базу благодаря применению в незначительных количествах (0,1 0,4% от массы протеазы) флуоресцентных органических соединений I-VI вместо применяемого в больших количествах (до 5% ) дефицитного и дорогого ронгалита (прототип); при этом сокращается продолжительность процесса осветления до 15 мин (прототип 30 мин 24 часа).

Использование: биотехнология, может быть применено в качестве биологически активной добавки к синтетическим моющим средствам для удаления со стираемых текстильных изделий из натуральных и химических волокон белковых загрязнений. Сущность изобретения: в состав сухого концентрата щелочной протеазы на стадии гранулирования вводят в незначительных количествах 0,1 - 0,4 мас. % флуоресцирующих в синей области спектра (400 - 500 нм) органических соединений, относящихся к производным 4,4'-бис(три-азиниламино)стильбен-2,2'-дисульфокислоты, кумарина, 5,6-бензокумарина, 1,3-дифенилпиразолина и бензоксазола.

Способ осветления щелочной протеазы путем проведения гранулирования экструзией смеси сухого концентрата щелочной протеазы, сульфата натрия, осветлителя и полиэтиленгликоля, отличающийся тем, что экструзии подвергают расплав полиэтиленгликоля с осветлителем, в качестве которого используют флуоресцирующее в синей области спектра органическое соединение, относящееся к производным 4,4'-бис(триазиниламино)-стильбен-2,2'-дисульфокислоты формулы

где R₁ и R₂ NH₂, NHAlk, N(Alk)₂, N(CH₂CH₂OH)₂,

или кумарина формулы

где R₁ и R₂ H, Alk, Ar, ArAlk;
R₃ N(Alk)₂, NHAlk,
или 5,6-бензокумарина формулы

где R₁-Ar, COOAlk,
или 1,3-дифенилпиразолина формулы

где R₁ H₁Cl;
R₂ SO₃Na, SO₂NH₂, SO₂Alk, COONa,
или бензоксазола формулы

где R₁ H, Alk,
вводимое в сухой концентрат щелочной протеазы в количестве 0,1 0,4 мас. и сульфата натрия.