СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА СОСУДИСТОГО ГОМОГРАФТА И СРЕДА ДЛЯ ХРАНЕНИЯ ПРЕПАРАТА Российский патент 1997 года по МПК A01N1/02 A61K35/44 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к кардиохирургии, в частности, к хирургии врожденных и приобретенных пороков сердца, и может быть использовано для приготовления и последующего хранения препаратов сосудистых гомографов, применяемых в качестве сосудистых биологических протезов, например, при операциях на сердце.

Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ приготовления препарата сосудистого гомографта и среда для его хранения. Способ включает забор сосудистого комплекса, его препаровку, стерилизацию и введение полученного продукта в среду для хранения. При этом препаровку сосудистого комплекса проводят в растворе натрия хлорида 0,9% (физиологическом), после чего производят стерилизацию смесью антибиотиков, которая содержит: цефокситин 240 г/л; линкомицина гидрохлорид 120 г/л; полимиксина B сульфат 100 г/л; ванкомицина гидрохлорид 50 г/л; амфотерицина B 25 г/л в физиологическом растворе, в течение 48 ч при температуре 4^oC. Затем полученный продукт помещают в среду для хранения, в которой препарат сосудистого гомографита хранится до момента использования в качестве сосудистого биологического протеза при операциях на сердце, но не более 28 дней. В качестве среды для хранения препарата сосудистого гомографта используют, например, питательную среду Игла.

Известный способ приготовления препарата сосудистого гомографта и среда для его хранения не позволяет обеспечить функционирование авторегуляторной системы защиты сосудистой ткани в условиях воздействия механических, физических, химических и временных факторов. Это обусловлено следующим. Хлорид натрия в водном растворе, используемый на стадиях препаровки и обработки антибиотиками, в принципе не способен образовывать комплексные соединения, а в среде Игла, используемой для хранения препарата сосудистого гомографта, не образуются комплексы, обладающие протективным действием в отношении сосудистой ткани, что не позволяет предотвратить негативное воздействие радикалов и продуктов клеток. Антибиотики, применяемые в способе-прототипе, способны сенсибилизировать при стерических трансформациях продуцирование относительно долгоживущего синглетного кислорода, что усиливает дегенеративные процессы в клетках и матриксе сосудистого комплекса. Кроме того обработка ванкомицина гидрохлоридом и линкомицина гидрохлоридом вызывает усиление внутренних повреждений клеток сосудистой ткани за счет активного вмешательства указанных антибиотиков в клеточный метаболизм и его ингибирования. Так ванкомицина гидрохлорид, представляющий собой сложный разветвленный полимер, содержащий четыре бензольных кольца и пять метильных групп, блокирует частично реакции обмена веществ в клетках.

Задачей изобретения является создание способа приготовления препарата сосудистого гомографта и среды для его хранения обеспечивающих функционирование авторегуляторной системы защиты сосудистой ткани в условиях воздействия механических, физических, химических и временных повреждений факторов.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе приготовления препарата сосудистого гомографта, включающем забор сосудистого комплекса, его препаровку, обработку антибиотиками и введение в среду для хранения, согласно изобретению перед и в ходе препаровки на сосудистый комплекс воздействуют реактивом, содержащим гемино-пептидный комплекс, обработку антибиотиками производят при введении полученного продукта в среду для хранения, содержащую гемино-пептидный комплекс, при осмолярности 550-600 ммоль/кг, причем используют антибиотики, не образующие при стерических трансформациях триплетные состояния с высвобождением долгоживущего синглетного кислорода. При этом в качестве реактива, содержащего гемино-пептидный комплекс, используют препарат "Аминокровин", а в качестве антибиотиков используют смесь цефотаксима и гентамицина сульфата в соотношении 8-9:1-2. Кроме того целесообразно в смесь антибиотиков дополнительно включать амфотерицин B в эффективных противогрибковых дозах, причем оптимальным являются использование смеси цефотаксина, гентамицина сульфата и амфотерицина B в соотношении 40-43:5-8: 1-2. Решение поставленной задачи достигается также тем, что среда для хранения препарата сосудистого гомографта, содержащая раствором солей и питательных веществ, согласно изобретению дополнительно содержит цефотаксим и гентомицина сульфат, а в качестве источника солей и питательных веществ используют препарат "Аминокровин" при следующем соотношении компонентов, г/л: цефотаксим 25,0±2,5; гентамицина сульфат 4,0±0,4; Аминокровин - остальное. При этом целесообразно дополнительно вводить амфотерицин B в концентрации 1,0±0,1 г/л.

Антибиотики, используемые в процессе приготовления препарата сосудистого гомографта, должны обеспечивать необходимый стерилизующий эффект, создавать осмолярность в пределах, оптимальная для функционирования системы авторегуляторной защиты сосудистой ткани, и не являться продуцентами относительно долгоживущего синглетного кислорода. Было найдено, что предъявляемым требованиям отвечают такие антибиотики, как цефотаксим и гентамицина сульфат, которые в соотношении 8-9:1-2 обеспечивают достижение оптимальных условий приготовления препарата сосудистого гомографта, включая необходимые параметры осмолярности, противобактериальный эффект и отсутствие радикалопродуцирующих структур. Для гарантирования предотвращения грибковых поражений при необходимости возможно введение в смесь противогрибковых антибиотиков, в частности, амфотерицина B в эффективных концентрациях. Лучшие результаты достигались при использовании смеси цефотаксима, гентамицина сульфата и амфотерицина B в соотношении 40-43:5-8:1-2. В этих условиях концентрация амфотерицина 8 достаточна для предотвращения грибковых поражений, при этом негативное действие, вызываемое его способностью образовывать относительно долгоживущий синглетный кислород, достаточно невелико и полностью нейтрализуется системой авторегуляторной защиты, функционирующей в заявленной среде.

Качественный и количественный состав среды подбирали исходя из необходимости добиться сочетания двух факторов обеспечения минимального повреждения структур кислых мукополисахаридов, коллагена, эластина и клеточных элементов сосудистой ткани и достижения стерилизующего эффекта. Экспериментально установлено, что концентрация компонентов. Экспериментально установлено, что концентрация компонентов, обеспечивающая соответствие предложенной среды указанным требованиям, составляет: цефотаксим 25,0±2,5 г/л; гентамицина сульфат 4,0±0,4 г/л; амфотерицин B (при необходимости) 1,0±0,1 г/л; Аминокровин остальное. При этом учитывали, что в процессе приготовления среды суммарная погрешность опыта составляет примерно 10%
Для подтверждения эффективности и достаточности предложенной комбинации антибиотиков в заявленных концентрациях для достижения стерилизующего эффекта было проведено две серии экспериментов. В первой серии производили проверку стерильности сосудистой ткани, находящейся в предложенной среде. Было проведено исследование 300 участков сосудистой ткани (по 100 участков опыт 1 и опыт 2 и 100 участков контроль), полученных из нестерильного секционного материала в патологоанатомическом отделении. В опытных группах сосудистую ткань выдерживали в течение 48 ч при температуре 0-4^oC в предложенной среде, содержащей в первом варианте смесь цефотаксима и гентамицина сульфата в Аминокровине (опыт 1), а во втором смесь цефотаксима, гентамицина сульфата и амфотерицина B в Аминокровине (опыт 2) в заявленных концентрациях. В контрольной группе сосудистая ткань хранилась в течение 48 часов в Аминокровине без антибиотиков. Затем вносили сосудистую ткань опытных и контрольной групп в тиогликолевую среду, где ее выдерживали в термостате в течении 8 сут. Производили посев (две пробы из каждой пробирки) на плотные питательные среды (кровяной агар, среда Эндо, элективный агар). В опытных группах все посевы стерильны. В контрольной группе 64 положительных высева. Результат статистически достоверный (p<0,001).

Во второй серии экспериментов для оценки эффективности стерилизации при использовании заявленной среды проведено следующее исследование: в 12 пробирок, содержащих по 2 мл. предложенной среды (смесь цефотаксима, гентамицина сульфата и амфотерицина B в Аминокровине), засеяны культуры Pseudomonas aeruginosa; Proteus mirabilis; Esherichia coli; Klebsiella pneumoniae; Serratia marcescens; Staphilococcus aureus; Candida Albicans. Для каждой культуры было взято по две пробирки с последующим высевом через 48 ч экспозиции на плотные питательные среды (кровяной агар: среда Эндо, элективный агар). Окончательный ответ: все 12 проб, в которые были засеяны возбудители, стерильны.

Достижение обеспечиваемого изобретением технического результата обусловлено следующим. По мнению авторов заявленного решения, одним из основных факторов, вызывающих повреждение клеток сосудистой ткани при нахождении ее в условиях длительной аноксии in vitro в процессе приготовления и хранения препарата, является негативное воздействие радикалов и продуктов деструкции клеток. Образование радикалов, при этом, по-видимому, может происходить различными путями. Ионы, сформировавшиеся в органической среде, в частности, в Аминокровине представляет собой радикалы с той или иной степенью защищенности ненасыщенной связи. При заборе сосудистого комплекса, его транспортировке и в процессе препаровки происходит взаимодействие поверхности слоев сосудистой ткани с аэроионами воздуха (отрицательными и положительными) и взаимодействие образовавшихся в ходе механической обработки сосудистой ткани биомолекул с ионами, предсуществующими в органической среде, с образованием вторичных ионов, часть из которых является реакционноспособными радикалами. Еще одним источником радикалов может являться система "свет сенсибилизаторы субстрат". Известно, что в результате воздействия света при наличии в среде сенсибилизаторов, в роли которых могут выступать, например, цитохромы клетки, пигменты остаточной крови, окрашенная молекула гема, образуется синглетный кислород, который воздействует на субстрат (например, митохондрии, цитоплазму, ядро клетки и другие органеллы) и вызывает повреждения снаружи и внутри клетки. В результате потери энергии сенсибилизированным синглетным кислородом также образуются радикалы, усиливающие повреждающее воздействие на сосудистую ткань во время начальных стадий приготовления препарата.

Было высказано предположение, что одним из возможных путей для предотвращения повреждений сосудистой ткани радикалами и продуктами деструкции клеток может быть использование материалов, содержащих гемино пептидный комплекс, например, препарата "Аминокровин". Известно, что Аминокровин является продуктов кислотного гидролиза белков крови человека с добавлением глюкозы. Он содержит свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды. Учитывая, что при приготовлении Аминокровина используется расщепленный белок сгустков крови и эритроцитарной массы, в составе гидролизата белков крови имеется также гемин. Известно, что гемин и полипептидные цепи глобина в крови образуют амфотерное четырех цепочечное комплексное соединение, существующее в цис- и транс-формах. Z-координата комплекса проходит через атом двухвалентного железа и расположена перпендикулярно к плоскости гема, сформированного четырьмя пиррольными кольцами и через азот соединенного с центральным атомом железа. По аналогии с пространственным расположением полипептидных цепей гемоглобина (4 гема для двух α-цепей с их пространственным зеркальным вариантов и 4 гема для двух b-цепей, также с зеркальным пространственным расположением) можно предположить, что в Аминокровине также ресинтезируются подобные комплексы гемина с остатком a и b полипептидных цепей глобина. Анализ, проведенный авторами заявленного решения, позволил установить, что положительные заряды концевых групп пептидов (слева) сформированы остатками лизина и гистидина, отрицательные заряды (справа) образованы остатками глютатиона и NH-группой (цис-форма). Размещение концевых групп в транс-форме следующее: слева-пептидная группа NH- (минус), лизин (плюс); справа-гистидин (плюс), глютатион (минус). Как показали экспериментальные исследования авторов предложенного способа, соотношение цис- и транс-форм в рацемической смеси Аминокровина составляет 50%50%/
По мнению авторов изобретения, геминовый комплекс с пептидными цепями (гемино-пептидный комплекс) обладающий амфотерными свойствами, гасит образующийся в процессе обработки сосудистой ткани радикалы и способствует, тем самым, снижению повреждающего действия начальных стадий приготовления препарата, в том числе стадии препаровки, где образование радикалов происходит как за счет оксигенации среды, так и за счет трансформации синглетного кислорода.

Известно, что повышение осмолярности среды приводит к интенсификации обмена веществ в клетке. При повышении интенсивности обмена веществ за счет смещения Доннановского равновесия, концентрационного индекса усиливается отток биомолекул из клетки в среду, в том числе, по-видимому, и токсических радикалов, образующихся за счет дегенеративных изменений включений клетки. Для понимания механизма протективного действия гемино-пептидного комплекса на стадии обработки сосудистой ткани антибиотиками авторами предложенного решения была определена осмолярность Аминокровина и заявленной среды для хранения. Оказалось, что содержащиеся в Аминокровине пептиды, высокомолекулярные соединения, не разрушившиеся в результате гидролиза, и аминокислоты создают осмолярность рассматриваемого реактива 420-480 ммоль/кг. Добавление двух антибиотиков цефотаксима и гентамицина сульфата в заявленных концентрациях приводит к повышению осмолярности смеси до 550-600 ммоль/кг (при введении амфотерицина B в предложенной концентрации в указанную смесь ее осмолярность существенно не изменялась).

При повышении осмолярности питательной среды рацемическая смесь цис- и транс- изомеров гемино-пептидного комплекса претерпевает изменения - равновесие в ней смещается в сторону более активной цис- формы. Как показали исследования авторов заявленного способа, содержание цис- формы гемино-пептидного комплекса при осмолярности среды, равной 550-600 ммоль/кг, соответствует 69-71% (как было указано выше, при осмолярности 420-480 ммоль/кг эта величина составляет 50%).

Повышенная концентрация цис-формы комплекса с активированными амфотерными пептидными группами приводит к усилению его взаимодействия с радикалами, токсическими аминокислотами и другими низкомолекулярными продуктами метаболизма и деструкции клеточных структур, снижение концентрации которых в среде приводит к уменьшению повреждений клеток и матрикса сосудистой ткани. Кроме того, учитывая, что с увеличением осмолярности раствора увеличивается сорбция высокомолекулярных комплексов соединенных на полупроницаемых мембранах, можно предположить, что цис-форма геминового комплекса с адендами из низкомолекулярных цепей, обладающая повышенным сродством к полимерам, входящим в состав мембраны, интенсивно сорбируются на оболочках и мембранах клеток сосудистой ткани. Известно, что все антибиотики подавляют клеточное дыхание по цепи цитохромов, при этом образуются недоокисленные продукты метаболизма клетки, часть из которых обладает токсическим действием на митохондрии. Относительно высокий молекулярный вес, которым обладают эти вещества, не позволяют им, по мнению авторов изобретения, свободно выходить в среду через мембранные структуры клетки. В то же время пептидные концевые группы геминового комплекса, сорбирующиеся на внешней стороне мембраны из-за сродстсва к белковой части мембраны, по-видимому, проникают через внутреннюю поверхность клеточной мембраны, создавая специфические активные центры, которые обладают способностью связывать недоокисленные продукты распада и детоксицировать их.

При увеличении осмолярности среды свыше 600 ммоль/кг содержание цис-формы практически не возрастает, но начинает проявляться тенденция к снижению активности гемино-пептидного комплекса, по-видимому, вследствие стерических затруднений.

Таким образом, на стадиях обработки антибиотиками и хранения препарата сосудистого гомографта увеличение в Аминокровине содержания более активной цис-формы геминового комплекса с адендами из низкомолекулярных пептидных цепей, а также повышение концентрации этого комплекса на оболочках и мембранах сосудистой ткани являются, по мнению авторов предложенного решения, основными механизмами, реализация которых позволяет очищать питательную среду от радикалов и деструктивных ингибиторов клеточного метаболизма.

Для доказательства, протективного действия гемино-пептидного комплекса были проведены эксперименты по приготовлению препарата сосудистого гомографта, где последовательность действия соответствовала заявляемому способу, но в качестве реактива для обработки промежуточного продукта перед и в ходе препаровки использовали Аминокровин с удаленным гемино-пептидным комплексом, а в качестве среды для хранения использовали среду, содержащую заявленную смесь антибиотиков (цефотаксим, гентамицина сульфат и амфотерицин B) и Аминокровин с удаленным гемино-пептидным комплексом при том же соотношении компонентов (далее модифицированный способ и модифицированная среда 1). Для приготовления указанного реактива Аминокровин подвергали диализу с полупроницаемой мембраной по способу, изложенному в работе. При этом крупная молекула гемино-пептидного комплекса не проникала через полупроницаемую мембрану, в то время как другие, более мелкие молекулы, включая аминокислоты, содержащиеся в Аминокровине, диффундировали через пленку. Для ускорения процесса разделение смеси проводили подо давлением, не превышающим 2 атм. Давление создавали азотом в специальном аппарате. Среду для хранения препарата готовили аналогично заявленной среде, используя вместо Аминокровина полученный как было указано выше реактив.

Оценку морфологической сохранности сосудистой ткани на разных стадиях приготовления препарата при использовании заявленного способа и модифицированного способа производили следующим образом. Объектом исследования являлась сосудистая ткань, полученная из секционного материала в патолого-анатомическом отделении и участки истмуса аорты, иссекаемые при лечении коарктации аорты. Характер изменений, наступающих в сосудистой ткани в процессе приготовления препарата с использованием заявленного и модифицированного способа, оценивали по данным световой и электронной микроскопии. Было проведено 10 пар исследований: результаты фиксировали на момент окончания препаровки, после обработки антибиотиками (через 48 ч) и при хранении в питательных средах (заявленной и модифицированной 1) в течении 12 часов, 48 ч, 12 сут. Отсчет времени хранения начинали по истечении 48 ч после внесения промежуточного продукта, полученного после препаровки, в заявленную и модифицированную среды. Было получено до 10 электронограмм для каждого образца (всего 200 для 10 пар исследований). Для количественной оценки каждой электронограммы подсчитывали относительное количество структур (например, клеток) с патологическими изменениями и без них. Анализ электронограмм позволил оценить степень сохранности сосудистой ткани по следующим показателям:
количество клеток с хроматином в гетерохромном состоянии (положительный индекс),
количество клеток с разрушенными и измененными органами (включая уплотнение или разрушение митохондрий, увеличение вакуолизации цитоплазмы, разрывы каналов эндоплазматической сети, разрыв плазматических мембран и потеря части цитоплазмы) (отрицательный индекс),
степень дегенеративного изменения матрикса сосудистой ткани (отрицательный индекс), Статистическую обработку данных электронограмм производили по разностному методу, с использованием вычислительных программ, реализованных на компьютере IBM PC.

Из данных видно, что показатели, характеризующие сохранность сосудистой ткани, при использовании Аминокровина с удаленным гемино-пептидным комплексом на всех стадиях приготовления препарата сосудистого гомографта хуже, чем при использовании заявленного способа и среды. Протективное действие гемино-пептидного комплекса особенно хорошо прослеживается по показателям, характеризующих сохранность органелл и наличие дегенеративных изменений матрикса. Так, на стадии препаровки в заявленном способе количество клеток с разрушенными и измененными органеллами было 7,3±3,19% а в модифицированном 16,5±3,56% что статистически достоверно p<0,05, на стадии обработки антибиотиками значения (соответственно 17,8±2,6% и 29,3±2,93%) достоверно отличаются (p<0,05), а на 12 сутки хранения препарата, после его стерилизации, значения (соответственно 30,6±3,04% и 52,4±2,8%) отличаются со степенью достоверности равной p<0,01. Частота появлений дегенеративных изменений матрикса в заявленном способе меньше, чем в модифицированном. Количество клеток с дегенеративным изменениями матрикса после обработки антибиотиками в заявленной среде составляет 9,5±2,2% а в среде с удаленным гемино-пептидным комплексом 28,7±1,64% что статистически достоверно с p<0,002, после 12 сут хранения дегенеративные изменения матрикса встречаются в заявленном способе 22±1,79% и 48,7±2,62% в заявленной среде с удаленным гемино-пептидным комплексом, что статистически значимо, со степенью достоверности p<0,01.

Таким образом анализ данных подтверждает предположение о том, что гемино-пептидный комплекс, ресинтезирующийся в Аминокровине, выступает в качестве протективного фактора на всех стадиях приготовления препарата сосудистого гомографта.

Оценку морфологической сохранности сосудистой ткани на разных стадиях приготовления препарата с использованием заявленного способа и среды, а также с использованием способа и среды прототипа производили по данным световой и электронной микроскопии, как было описано выше. Результаты фиксировали на момент окончания препаровки, после обработки антибиотиками (через 48 ч) и при хранении в питательных средах (заявленной и среде Игла) в течении 12 ч, 48 ч и 12 сут. С целью обеспечения адекватности результатов экспериментов в заявленном способе отсчет времени хранения начинали по истечении 48 ч после внесения полученного после препаровки промежуточного продукта в заявленную среду.

Из данных видно, что после препаровки сосудистого комплекса в заявленной среде количество клеток с хроматином находящемся в гетерохромном состоянии было 92,0±3,25% что соответствует таковому in vivo. После препаровки в физиологическом растворе (по способу-прототипу) только 79,3±2,23% Разница получения результатов статистически достоверна (p<0,05). Еще более существенные негативные сдвиги отмечаются при сравнительном анализе следующего показателя количество клеток с разрушенными или измененными органеллами на стадии обработки антибиотиками. Уплотнение или разрушение митохондрий, увеличение вакуолизации цитоплазмы, разрывы каналов эндоплазматической сети, разрыв плазматических мембран и потери части цитоплазмы зафиксированы в заявленном способе в 17,8±2,6% тогда как в способе прототипе эта величина достигает 28,9±3,02% достоверность p<0,05. Дегенеративные изменения матрикса в сосудистой ткани после обработки антибиотиками в заявленном способе составляет 9,5±2,2% а в способе прототипа 20,8±2,52% Эта разница статистически достоверна с уровнем достоверности p<0,05, что подтверждает более глубокие деструктивные изменения, наступающие в сосудистой ткани в способе-прототипе.

На стадии хранения препарата возрастают различия по сравнению с предыдущими стадиями в значении первого из рассматриваемых показателей. В заявленном способе количестве клеток, сохраняющих хроматин в гетерохромном состоянии, в зависимости от времени хранения превышает аналогичный показатель способа прототипа в 1,7-2,01 раза (через 12 часов хранения соответственно 76,4±4% и 44,9±2,11% достоверность p<0,01; через 48 ч 71,5±3.5% и 35,5±3,83% достоверность p<0,02). Дегенеративные изменения матрикса и повреждения органелл в клетках в способе-прототипе более выражены при хранении препарата, причем разница во всех точках забора была статистически достоверна.

Таким образом результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что использование заявленного способа и среды обеспечивает повышение морфологической сохранности ткани по сравнению со способом прототипом. При этом сопоставительный анализ таблиц 1 и 2 показывает, что именно гемино-пептидный комплекс, ресинтезирующийся в Аминокровине, оказывает на сосудистую ткань протективное действие, механизмы которого различны на разных стадиях приготовления препарата. Причем указанные механизмы авторегуляторной защиты функционируют в том или ином виде как на ранних этапах обработки сосудистой ткани, включая препаровку, так и на этапах обработки антибиотиками, а также в течение всего разумного срока хранения.

Авторами заявленного решения было сделано предположение, что на поздних стадиях приготовления препарата сосудистого гомографта необходимым условием для эффективного функционирования гемино-пептидного комплекса, как средства предотвращения радикальных процессов, является не только создание оптимальных параметров осмолярности, обеспечивающих его нахождение в растворе преимущественно в более активной цис-форме, но и отсутствие продуцирования активного сиглетного кислорода в количествах, превышающих протективную емкость указанного комплекса.

Анализ возможных (для целей изобретения) антибиотиков показал, что большинство из них способны при стерических трансформациях образовывать шестичленные кольца в результате взаимодействия метильных групп с карбоксильными группами. При этом при относительно небольших энергетических затратах происходит разрыв двойной связи C=O с образованием синглетного кислорода, который может служить дополнительным источником радикальных процессов. Известно, что при взаимодействии сенсибилизатора с высокой энергией триплетного состояния (E_т), превышающей 39,914 ккал/моль, образуется преимущественно короткоживущая (10^-12 c) ′Σ+g

форма синглетного кислорода. Если энергия сенсибилизатора находится в пределах 21,989<E_т<38,002 ккал/моль, образуется в основном долгоживущая форма ′Δ_g (10^-6c), если энергия E_т находится в пределах 38,002<E_т <39,914 ккал/моль, то соотношение ′Δ_g и ′Σ+g близко к 50% Верхний предел образования формы ′Σ+g как было установлено расчетным путем, соответствует 45,0 ккал/моль.

Известно, что выделение относительно долгоживущего синглетного кислорода (10^-6 c) можно описать формулой автокаталитической реакции. В этой формуле один из сомножителей, так называемый фактор "B", являющийся катализатором указанной реакции, продуцируется сенсибилизаторами, в качестве которых могут выступать полициклические углеводороды и другие ароматические соединения, в том числе антибиотики, содержащие метильные группы с низкоэнергетическими связями (<38 ккал/моль). Минимально значимая концентрация фактора "B", при которой начинаются реакции автокатализа, является переменной величиной и зависит от ряда параметров, таких как температура, концентрация солей в растворе, стерических факторов, электропроводности раствора и др. Исходя из формулы для продукции кислорода, было определено, что вероятная граничная концентрация катализатора соответствует 0,0002 моль/л. Учитывая, что фактор "B" эквимолярен продукции синглетного кислорода, вероятная граничная концентрация долгоживущего синглетного кислорода в среде (при которой происходит переход в режим автокатализа) будет также соответствовать 0,002 моль/л.

Для доказательства оптимальности выбора антибиотиков в заявленном способе по сравнению со способом-прототипом, исходя из предположения, что действующим началом, усиливающим дегенеративные процессы в клетках сосудистой ткани, является синглетный кислород, были проведены на ЭВМ расчеты энергий связи метильных групп в антибиотиках, используемых в заявленном способе и способе-прототипе, и энергий триплетного состояния участков молекул этих антибиотиков, сенсибилизирующих образование двух форм синглетного кислорода ′Δ_g и ′Σ+g

. Расчеты проведены исходя из структуры антибиотиков с использованием формул, описывающих переходное состояние с учетом условий стерической трансформации, образования и расщепления электронных пар, пороговой величины активного света, диполь-дипольных взаимодействий, а также внутренней энергии взаимодействия.

Из данных видно, что в заявленном способе только амфотерицин B, содержащий одну активную метильную группу (E_т=30,2 ккал/моль), способен сенсибилизировать продуцирование относительно долгоживущей формы ′Δ_g синглетного кислорода (10^-6 c). Гентамицина сульфат сенсибилизирует образование короткоживущей (10^-12 с) ′Σ+g

формы синглетного кислорода (метильная группа с E_т= 41,2 ккал/моль).

В способе-прототипе ванкомицина гидрохлорид сенсибилизирует образование двух молекул короткоживущего синглетного кислорода ′Σ+g

(метильные группы с E_т 41,4 ккал/моль и E_т=41,9 ккал/моль). Учитывая энергию сенсибилизации третьей активной метильной группы этого антибиотика (E_т=38,8 ккал/моль), в растворе также образуется примерно 50% ′Δ_g и 50% ′Σ+g Линкомицина гидрохлорид содержит две метильные группы, способные сенсибилизировать образование как ′Σ+g (E_т=41,7 ккал/моль), так и ′Δ_g (E_т-38,0 ккал/моль) формы синглетного кислорода. Полимиксина B сульфат имеет одну метильную группу, по энергетике (E_т= 41,7 ккал/моль) способную сенсибилизировать синтез короткоживущего синглетного кислорода ′Σ+g В этот перечень следует (как и в заявленном способе) включить также амфотерицин B, сенсибилизирующий, как было указано выше, продуцирование синглетного кислорода в ′Δ_g форме.

Сравнение заявляемой комбинации антибиотиков и комбинации антибиотиков способа-прототипа показывает, что в предложенном способе только две метильные группы способны сенсибилизировать образование синглетного кислорода, причем только одна из них относительно долгоживущего и, поэтому наиболее активно взаимодействующего с клеточными структурами и матриксом синглетного кислорода ′Δ_g проявляющего деструктивное действие. В способе-прототипе при прочих равных условиях 7 метильных групп способны сенсибилизировать продуцирование в растворе синглетного кислорода, причем три из них относительно долгоживущего синглетного кислорода ′Δ_g
Основываясь на данных, с учетом молекулярного веса и концентрации антибиотиков, долевого вклада метильных групп и процента образующегося синглетного кислорода были рассчитаны концентрации фактора "B", продуцируемого антибиотиками заявленного способа и способа-прототипа. При этом было установлено, что амфотерицин B продуцирует 0,00007 моль/л фактора "B" при концентрации антибиотика 1 г/л (заявленный способ) и 0,00018 моль/л фактора "B" при концентрации 25 г/л (способ-прототип). Ванкомицина гидрохлорид продуцирует 0,0026 моль/л, а линкомицина гидрохлорид 0,016 моль/л фактора "B". Сопоставление приведенных величин с указанной выше вероятной граничной концентрацией фактора "B" (0,0002 моль/л) показывает, что при использовании смеси антибиотиков способа-прототипа концентрация продуцируемого каждым из этих антибиотиков фактора "B" и, соответственно, суммарная концентрация его в растворе (0,0188 моль/л) превышает предельную концентрацию этого фактора и следовательно концентрацию относительно долгоживущего синглетного кислорода, при которой происходит запуск реакции автокатализа. В этих условиях при гипотетическом использовании комбинации антибиотиков прототипа вместо заявленной комбинации антибиотиков при сохранении последовательности действий предложенного способа создается вероятность превышения протективной емкости гемино-пептидного комплекса, что приведет к резкому уменьшению его защитных свойств. При использовании заявленных антибиотиков суммарная концентрация фактора "B" в растворе (которая определяется в этом случае исключительно продукцией амфотерицина B) приблизительно она два порядка меньше его вероятной граничной концентрации, что исключает возможность развития автокаталитической реакции и позволяет гемино-пептидному комплексу полностью нейтрализовать образующийся синглетный кислород. Это позволяет при рассмотрении механизма реализации протективного действия гемино-пептидного комплекса не учитывать образующийся в пренебрежимо малых количествах фактор "B" и условно считать, что амфотерицин B в заявленной концентрации не является продуцентом относительно долгоживущего синглетного кислорода.

Для подтверждения негативного воздействия антибиотиков, предусмотренных способом-прототипом, на протективные свойства гемино-пептидного комплекса были проведены эксперименты по приготовлению препарата сосудистого гомографта, где последовательность действий соответствовала заявленному способу, но в качестве среды для хранения использования Аминокровин с добавлением комбинации антибиотиков способа-прототипа, включающей: цефокситин 240 г/л; линкомицина гидрохлорид 120 г/л; полимиксина B сульфат 100 г/л; ванкомицина гидрохлорид 50 г/л; амфотерицин B 25 г/л (далее модифицированная среда 11). Осмолярность модифицированной среды 11 составляла 620-650 ммоль/кг.

Из данных видно, что показатели, характеризующие сохранность сосудистой ткани, при использовании в качестве среды для хранения Аминокровина с добавлением комбинации антибиотиков среды-прототипа, существенно хуже, чем при использовании заявленной среды. Так количество клеток с разрушенным и измененными органеллами на стадии обработки антибиотиками превышает аналогичный показатель заявленного способа в 1,01 раза (соответственно 28,8±2,67 и 17,8±2,6) и в 1,49 раза через 12 суток хранения. Дегенеративные изменения матрикса встречаются при использовании модифицированной среды 11 в 2,16 раза чаще, чем при использовании заявленной среды в ходе обработки антибиотиками и в среднем в 1,48 раза чаще в процессе хранения препарата.

Сопоставительный анализ данных позволяет сделать вывод, что введение в среду для хранения препарата сосудистого гомографта антибиотиков, способных продуцировать относительно долгоживущий синглетный кислород, практически полностью блокирует протективное действие гемино-пептидного комплекса.

Таким образом именно заявленная совокупность действия и заявленный качественный и количественный состав среды для хранения в процессе приготовления препарата сосудистого гомографта позволяет обеспечить функционирование авторегуляторной системы защиты сосудистой ткани в условиях воздействия механических, физических, химических и временных повреждающих факторов. При этом из известного уровня техники не выявляется, по мнению заявителей, влияния предписываемых изобретением преобразований, характеризуемых отличительными от прототипа существенными признаками, на достижение технического результата.

Способ осуществляют следующим образом. Производят забор магистральных сосудов с клапанами на трупе с временем тепловой ишемии не более 18 ч. Помещают сосудистый комплекс в стерильный пакет с охлажденным до 4^oC Аминокровином. Производят препаровку сосудистого комплекса в охлажденном Аминокровине, включающую отделение адвентиции от сосуда, удаление части миокарда возле клапана, перевязку сосудов второго порядка, стандартизацию полученного препарата. Вводят полученный продукт в среду для хранения, где происходит его обработка антибиотиками, как правило, входящими в состав среды, например, смесью цефотаксима и гентамицина сульфата в соотношении 8-9:1-2. Для гарантированного предотвращения грибковых поражений при необходимости возможно введение в смесь амфотерицина B, при этом оптимальным является [2] использование смеси цефотаксима, гентамицина сульфата и амфотерицина B в соотношении 40-43:5-8:1-2. Обработку антибиотиками производят при осмолярности 550-600 ммоль/кг, которую определяют, например, с помощью осмометра ОМКА 1Ц-01. Все стадии приготовления препарата сосудистого гомографта и его дальнейшее хранение, осуществляют при температуре 0-4^oC.

Среду для хранения готовят путем растворения необходимых количеств компонентов в Аминокровине из расчета: цефотаксин 25,0±2,5 г/л; гентамицина сульфат 4,0±0,4 г/л; Аминокровин остальное. В случае необходимости в среду дополнительно вносят амфотерицин B из расчета 1,0±0,1 г/л.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления 200 мл среды для хранения препарата сосудистого гомографта 5,0±0,5 г цефотаксима растворяли в 50 мл Аминокровина, затем в полученный раствор добавляли 20±2 мл 4% раствора гентамицина сульфата, после чего добавляли Аминокровин до 200 мл.

Пример 2. Произвели забор сосудистого комплекса, включающего аорту с аортальным клапаном, на трупе с временем тепловой ишемии 15 ч. Поместили сосудистый комплекс в стерильный пакет с охлажденным до температуры 4^oC Аминокровином. В таком виде исходный материал транспортировался до места проведения дальнейшей обработки 4 ч. Произвели препаровку сосудистого комплекса в Аминокровине, в ходе которой была отделена адвентиция, отсечен миокард, при этом оставлена узкая полоска миокарда вокруг клапанного кольца и сохранена передняя створка митрального клапана. Перевязаны коронарные сосуды и аортальная связка. Произведена стандартизация препарата: Диаметр клапанного кольца 26 мм, длина восходящей части аорты и дуги 15 см. Ввели полученный продукт в среду для хранения, приготовленную согласно примеру 1, где происходила обработка его смесью антибиотиков, входящих в состав среды, при осмолярности 560 ммоль/кг. Осмолярность среды определяли с помощью осмометра ОМКА 1Ц-01. Выдержали препарат в течении 48 ч, в этом растворе при температуре 4^oC. Проверку стерильности препарата проводили путем посева на плотные питательные среды, среды обогащения по методике [3] Оценку стерильности осуществляли на стадии забора, транспортировки и заключительную оценку через 48 ч выдерживания препарата в среде для хранения. Результат проверки все посевы стерильны. Препарат был использован на 17-е сутки хранения в заявленной среде (отсчет с момента внесения препарата в среду) при температуре 4^oC. Предварительно провели оценку морфологической сохранности сосудистой ткани по данным световой и электронной микроскопии по методике [11] Анализ электронограммы дал следующие результаты:
количество клеток с хроматином, находящемся в гетерохромном состоянии - 67,5±3,54%
количество клеток с разрушенными и измененными органеллами (включая уплотнение или разрушение митохондрий, увеличение вакуолизации цитоплазмы, разрыв плазматических мембран и потеря части цитоплазмы, разрушение лизосом) - 31,3±27%
степень дегенеративных изменений матрикса сосудистой ткани - 18,5±3,37%
Пример 3. Ребенок К. 9 лет. История болезни 10615. Диагноз: Врожденный порок сердца (ВПС). Двойное отхождение магистральных сосудов от правого желудочка. Дефект межжелудочковой перегородки, расположенный под легочной артерией. (Аномалия Тауссиг-Бинга).

Состояние после операций: Устранение коарктации аорты и сужения легочной артерии (операция Мюллера) в возрасте 6 месяцев: Наложение правостороннего, модифицированного подключично-легочного шунта по Блелоку (Gore-Texs 5).

Осложнения: Недостаточность кровообращения 2А ст. Хроническая гипоксемия.

Операция (сентябрь 1992 г.): "Демус-Кей-Стенселл". Закрытие дефекта межжелудочковой перегородки. Закрытие входа в аорту заплатой из Gore-Texs. Наложение анастомоза между стволом легочной артерии и восходящей аортой. Соединение правого желудочка и легочных артерий с помощью сосудистого клапанного препарата (гомографта), приготовленного согласно примеру 2.

Оценка функционирования полулунных клапанов сосудистого гомографта производилась с помощью ультразвукового исследования, оценки в динамике цветного Допплер эффекта ежедневно в течении двух недель после операции и каждые три месяца в течении 2 лет. Результат: работа клапанов удовлетворительная. Трансклапанного градиента на гомографте нет, недостаточности клапанов гомографта нет.

Пример 4. Для приготовления 200 мл среды для хранения препарата сосудистого гомографта 5,0±0,5 г цефотаксима растворили в 50 мл. Аминокровина, затем в полученный раствор добавили 20±2 мл. 4% раствора гентамицина сульфата и 40 мл раствора, содержащего 0,2±0,002 мг амфоторицина B в Аминокровине, после чего добавляли Аминокровин до 200 мл.

Пример 5. Произвели забор сосудистого комплекса, включающего легочную артерию с легочным клапаном, правую и левую легочную артерию, на трупе с временем тепловой ишемии 12 ч. Условия транспортировки аналогичны примеру 2. Время транспортировки 3 ч. Произвели препаровку сосудистого комплекса в Аминокровине. При этом была отделена адвентиция, отсечен миокард с оставлением узкой полоски вокруг клапанного кольца. Перевязка артериальной связки. Стандартизация препарата: диаметр клапанного кольца 26 мм. длина ствола легочной артерии 70 мм. Правая и левая легочные артерии 55 мм и 48 мм (соответственно) выделены до деления на сегментарные. Ввели полученный продукт в среду для хранения, приготовленную согласно примеру 4. Дальнейшая обработка аналогична примеру 2, при осмолярности среды 580 ммоль/кг. Проверку стерильности проводили аналогично примеру 2. Результаты проверки все посевы стерильны. Препарат был использован на 8-е сутки хранения (отсчет времени с момента внесения препарата в среду для хранения). Оценка морфологической сохранности производилась аналогично примеру 2. При этом получены следующие показатели:
количество клеток с хроматином находящемся в гетерохромном состоянии - 70,4±3,57%
количество клеток с разрушенными и измененными органеллами - 28,8±2,76%
степень дегенеративных изменений матрикса сосудистой ткани 16,5±3,42%
Пример 6. Ребенок Ф. 3 года. История болезни 12614. Диагноз: ВПС. Общий артериальный ствол тип 11. Дефект межжелудочновой перегородки. Состояние после сужения легочной артерии в возрасте 8 мес. Осложнения: Легочная гипертензия правого легкого и гиповолемия левого легкого. Недостаточность кровообращения 2 А ст. Операция (декабрь 1993 г). Закрытие дефекта межжелудочковой перегородки. Протезирование ствола легочной артерии, правой и левой легочной артерии бифуркационным, клапаносодержащим легочным сосудистым гомографтом, приготовленным согласно примеру 5. Пластика восходящей части аорты.

Оценка функционирования полулунных клапанов сосудистого гомографта производилась аналогично примеру 3. Наблюдение после операции 6 месяцев. Нарушений гемодинамики гомографта нет. Трансклапанный градиент отсутствует. Недостаточности клапанов гомографта нет.

Таким образом заявленный способ приготовления препарата сосудистого гомографта и среда для его хранения обеспечивают функционироание авторегуляторной системы защиты сосудистой ткани в условиях воздействия механических, физических, химических и временных повреждающих факторов.

Изобретение относится к медицине, преимущественно кардиохирургии для приготовления и последующего хранения препаратов сосудистых гомографтов. Создание способа и среды обеспечивает функционирование авторегуляторной системы защиты сосудистой ткани в условиях воздействия механических, химических и временных повреждающих факторов. Сущность изобретения: производят забор сосудистого комплекса, его препаровку, обработку антибиотиками и введение в среду для хранения. Перед и в ходе препаровки на сосудистый комплекс воздействуют реактивом, содержащим гемино-пептидный комплекс, в качестве которого используют препарат "Аминокровин". Обработку антибиотиками производят при введении полученного продукта в среду для хранения, содержащую гемино-пептидный комплекс, при осмолярности 550-600 ммоль/кг. Используют антибиотики, не образующие при стерических трансформациях триплетные состояния с высвобождением долгоживущего синглетного кислорода, например, смесь цефотаксима и гентамицина сульфата в соотношении 8-9:1-2. Кроме того целесообразно в смесь антибиотиков дополнительно включать амфотерицин В в эффективных противогрибковых дозах, причем оптимальным является использование смеси цефотаксима, гентамицина сульфата и амфотерицина В в соотношении 40-43 : 5-8 : 1-2. Среда для хранения препарата содержит в качестве источника солей и питательных веществ препарат "Аминокровин", а также дополнительно содержит цефотаксим и гентамицина сульфат при следующем соотношении компонентов, г/л: цефотаксим 25,0±2,5; гентамицина сульфат 4,0±0,4; Аминокровин - остальное. Целесообразно дополнительно вводить амфотерицин В в концентрации 1,0±0,1 г/л. 2 с. и 5 з.п. ф-лы.

1. Способ приготовления препарата сосудистого гомографта, включающий забор сосудистого комплекса, его препаровку, обработку антибиотиками и введение в среду для хранения, отличающийся тем, что перед и в ходе препаровки на сосудистый комплекс воздействуют реактивом, содержащим геминопептидный комплекс, обработку антибиотиками производят при введении полученного продукта в среду для хранения, содержащую геминопептидный комплекс, при осмолярности 550 600 ммоль/кг, причем используют антибиотики, не образующие при стерических трансформациях треплетные состояния с высвобождением долгоживущего синглетного кислорода. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве реактива, содержащего геминопептидный комплекс, используют препарат "Аминокровин". 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве антибиотиков используют смесь цефотаксима и гентамицина сульфата в соотношении 8 9 1 - 2. 4. Способ по пп.2 и 3, отличающийся тем, что в смесь антибиотиков дополнительно включают амфотерицин B в эффективных противогрибковых дозах. 5. Способ по пп.2 4, отличающийся тем, что используют смесь цефотаксима, гентамицина сульфата и амфотерицина B в соотношении 40 43 5 - 8 1 2. 6. Среда для хранения препарата сосудистого гомографта, содержащая растворы солей и питательных веществ, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит цефотаксим и гентамицина сульфата, а в качестве источника солей и питательных веществ препарат "Аминокровин" при следующем соотношении компонентов, г/л:
Цефотаксим 22,0 27,5
Гентамицина сульфат 3,6 4,4
Аминокровин До 1 л
7. Среда по п.6, отличающаяся тем, что в нее дополнительно вводят амфотерицин B в концентрации 0,9 1,1 г/л.