СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО СОСУДИСТОГО ПРОТЕЗА Российский патент 2022 года по МПК A61F2/06 A61F2/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к сердечно-сосудистой хирургии. Может быть использовано в отделениях сердечно-сосудистой хирургии.

Вся история и прогресс сосудистой хирургии неразрывно связаны с созданием и совершенствованием сосудистых протезов, применяемых при различных оперативных вмешательствах. О нерешенности проблемы выбора вида протеза при конкретной клинической ситуации говорит огромное количество существующих на данный момент типов трансплантатов и отсутствие четких рекомендаций по их применению. На сегодняшний день вариантом выбора при шунтирующих и протезирующих операциях являются синтетические протезы. Однако существует ряд клинических случаев, когда их применение невозможно.

Биологические сосудистые протезы используются при замещении артерий малого диаметра (от 6 мм и меньше), так как синтетические протезы такого диаметра зачастую подвергаются тромбозу, что приводит к их дисфункции [1].

Другим вариантом использования биологических сосудистых протезов является комплексное хирургическое лечение инфекции ранее установленного синтетического протеза. При этом удаляют старый инфицированный синтетический протез и замещают его биологическим протезом, более устойчивым к инфекционному процессу [2].

В настоящее время существуют следующие варианты биологических сосудистых протезов.

1. Аутографты - сосудистые протезы, изготавливаемые из ткани непосредственно самого реципиента.

2. Аллографты (гомографты) - это протезы, получаемые из ткани представителя того же вида.

3. Ксенографты представляют собой ткани, взятые от представителя другого вида, чаще всего от свиньи или крупного рогатого скота [1].

Известен способ изготовления биологического протеза методом дубления биологических тканей глутаровым альдегидом. Методика впервые была предложена в 1969 году A. Carpentier. В дальнейшем способ получил большое распространение и неоднократно модифицировался. В различных вариантах применялась разная концентрация глутарового альдегида (от 0,25% до 0,625% и более) при низком (2-4 мм рт.ст.) или нулевом давлении [3]. Недостатками предложенного способа является невозможность длительного хранения, коллагеновая денатурация протезов, повышенная кальцификация графтов и их низкая проходимость в отдаленном периоде, токсичность используемых химических агентов.

Существует способ приготовления биологического протеза, который включает в себя забор сосудистого комплекса, его препаровку, стерилизацию и введение полученного продукта в среду для хранения. При этом препаровку проводят в 0,9% растворе натрия хлорида (физиологический раствор), а затем вводят в среду для обработки сосудистого комплекса, представляющую собой смесь антибиотиков в физиологическом растворе в концентрации: цефокситин 240 г/л; линкомицина гидрохлорид 120 г/л; полимиксина В сульфат 100 г/л; ванкомицина гидрохлорид 50 г/л; амфотерицина В 25 г/л. Обработку ткани проводят в течение 48 ч при 4°С, после чего полученный продукт помещают в среду для хранения - питательную среду [4]. Недостатками предложенного способа является невозможность длительного хранения, отсутствие надежной консервации и сшивающего эффекта, сохранение высокой антигенной нагрузки на реципиент, повышенная кальцификация графтов.

Описан способ изготовления биологического протеза методом обработки раствором ДМЭМ-Ф12. Технология изготовления включает в себя изъятие из трупа участка магистральных сосудов. Затем полученный препарат подвергается обработке средой, представляющей собой водный раствор, содержащий 0,05-0,5% гентамицина сульфата, 8,0-12,0% дифлюкана и 0,1-0,5% компонентов фосфатного буферного раствора в течение 30 минут. Затем на стадии препаровки протез обрабатывается в среде с рН 7,0-7,4, представляющей собой раствор ДМЭМ-Ф12, содержащий 3,0-7,0% дифлюкана, 0,05-0,1% гентамицина сульфата, 1,5-3,0% цефалоспорина, 0,1-0,3% метрогила и 0,3-0,5%. компонентов фосфатного буферного раствора. Протез хранится в среде, представляющей собой раствор ДМЭМ-Ф12, содержащий 8,0-12,0% дифлюкана, 0,05-0,15% гентамицина сульфата и 0,1-0,5% компонентов фосфатного буферного раствора [5]. Недостатками предложенного способа является невозможность длительного хранения, отсутствие надежной консервации и сшивающего эффекта, сохранение высокой антигенной нагрузки на реципиент, повышенная кальцификация графтов.

За прототип предлагаемого способа был взят способ изготовления биологического протеза методом обработки биологических тканей эпоксисоединениями. Методика разработана в 1987-1989 годах японскими учеными (Nojri et al., Muruyama Y et al., Noishiki Y et al.). Данный способ претерпел различные модификации. В качестве основного химического агента использовались полиглицидиловый эфир глицерола, полиглицидиловый эфир полиглицерола, полиэтиленгликоль, диглицидиловый эфир этиленгликоля. Применяемые концентрации растворов 2-5%. Время изготовления - 15-20 суток при температуре 20-25°С и рН 7,4 [6]. Недостатками предложенного метода является невозможность длительного хранения, выраженная цитотоксичность, короткий антибактериальный эффект.

Целью изобретения является внедрение в клиническую практику способа изготовления биологического сосудистого протеза, который был бы герметичным, атромбогенным, стерильным, нетоксичным, иммунологически инертным к окружающим тканям, имел бы высокую прочность и длительный срок функционирования и хранения.

Предложенный способ реализуется следующим образом.

Этап 1. Забор аутопсийного материала. Проводят с помощью хирургического инструментария в течение 4-24 часов после летального исхода (рисунок 1). Забирают участок нативного сосуда.

Этап 2. Препаровка материала. Выполняют с помощью хирургического инструментария с удалением соединительной ткани (рисунок 2). После проведенных манипуляций препарат отмывают от сгустков крови и помещают в 1% раствор формальдегида, в пластиковую тару объемом 500 см³.

Этап 3. Антимикробная обработка протеза. Реализуют в 1% растворе формальдегида, в герметичной таре объемом 3000 см³ при температуре +20°С и отсутствии прямого воздействия солнечных лучей в течение 7 дней. По истечению срока протез извлекают из раствора формальдегида и отмывают физиологическим раствором.

Этап 4. Децеллюляризация протеза. Проводят в растворе гексана чистого для анализа, в герметичной таре объемом 3000 см³ и морозильной установке размерами 50x50 см при температуре -18°С в течение 14 дней. Во время данного периода из тары периодически удаляют излишки воды. По истечению срока протез извлекают из раствора и отмывают физиологическим раствором.

Этап 5. Хранение. Полученный в результате предыдущих этапов биологический протез (рисунок 3) помещается в раствор гексана чистого для анализа, где происходит его дальнейшее хранение.

Для оценки свойств полученного биологического сосудистого протеза был проведен ряд экспериментальных исследований.

Физические свойства протеза были изучены на универсальной испытательной машине согласно ГОСТ. Эластичность протеза колебалась в пределах 0,7-0,9 МПа. Плотность составила 1060 кг/м³. Растяжимость оценивалась до момента разрыва экспериментального образца. Получены значения в диапазоне от 1,1-1,9 МПа, подтверждающие удовлетворительные прочностные характеристики протеза.

Далее была проведена электронная микроскопия экспериментальных образцов. Исследование проводилось на растровом электронном микроскопе «Supra-25» («Carl Zeiss», Германия). На полученных микрофотографиях отмечается дифференцировка всех слоев сосудистой стенки биологического протеза, отсутствие повреждений внутренней оболочки, а также сохранность структурной организации эластических волокон (рисунок 4).

Следующим этапом выполнялось гистологическое исследование протеза. Препараты окрашивались с использованием гематоксилина и эозина, гематоксилина и пикрофуксина по методу Ван-Гизона. На микропрепарате сосуда до обработки отмечается нормальная клеточная структура стенки, дифференцируемость слоев, сохранность соединительнотканного каркаса (рисунок 5). На микропрепарате биологического сосудистого протеза наблюдается эффект децеллюляризации - отсутствие клеточных ядер и цитоплазмы. Однако при этом остаются полностью сохранными эластические волокна (рисунок 6).

Децеллюляризация - удаление из препарата клеточного содержимого -является важным показателем иммунологической инертности биологического сосудистого протеза. Эффект децеллюляризации оценивали методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Исследование проводилось на лабораторной установке, которая включала в себя диодный лазер (LML-785.0RB-04), оптический рамановский модуль (PBL 785), спектрограф (Sharmrock SR-303i) со встроенной цифровой камерой (ANDOR DV-420A-OE) и компьютер. Анализ спектров комбинационного рассеяния позволил установить, что для биологического протеза интенсивность пика 1337 см^-1 (деформация белков и нуклеиновых кислот) ниже по сравнению с сосудами до химической обработки (рисунок 7). Следовательно, в результате обработки в протезе снижается количество молекул ДНК, что приводит к уменьшению его иммунологической реактивности.

Длительность хранения протеза без признаков изменения структуры, цвета и консистенции составила на момент исследования 36 месяцев.

Далее проведено изучение характеристик протезов после их имплантации в живой организм. Исследование проводилось на 6 половозрелых крысах породы Wistar. Распределение по половому признаку: 4 особи мужского пола и 2 - женского. Средняя масса составила 355±84,02 гр.

Для выполнения оперативных вмешательств проводилась инъекционная общая анестезия. Использовались препараты «Золетил» (Тилетамина гидрохлорид + Золазепам) в дозировке 15 мг/кг и «Рометар» (Ксилазина гидрохлорид) в дозировке 15 мг/кг. Инъекции выполнялись подкожно в зону холки. Оперативные вмешательства проводились в стерильной операционной. После обработки операционного поля 70% спиртовым раствором хлоргексидина выполнялся разрез в шейно-затылочной области крысы и тупым способом формировался подкожный карман. В полученный карман имплантировался участок биологического сосудистого протеза.

Наблюдение за крысами включало в себя ежедневный осмотр кожных швов, измерение температуры, измерение массы тела.

Выведение из эксперимента осуществлялось по следующей схеме. Введение в общий наркоз введением «Золетила» подкожно из расчета 15 мг/кг. После достижения эффекта выполнялся прямой забор артериальной крови из левого желудочка сердца. Затем интракардиально вводился «Золетил» в объеме 2 мл. После наступления смерти животного выполнялся забор имплантированного протеза с окружающими тканями, окружающих лимфатических узлов, селезенки, печени, сердца. Артериальная кровь анализировалась на гематологическом аппарате «Mindray» (Китай). Оценивались показатели общего анализа крови.

Результаты наблюдения представлены в таблице 1.

Во всех группах отсутствовали воспалительные изменения (гиперемия, отек) послеоперационных ран. Все животные набрали в весе. Все швы заживали первичным натяжением. Данные результаты подтверждают иммунологическую инертность и стерильность биологического протеза.

При гистологическом исследовании воспалительные явления вокруг протеза отсутствуют, сформирована рубцовая ткань (рисунок 8). Сохраняется незначительная лейкоцитарная инфильтрация протеза (рисунок 9). Регионарные лимфатические узлы без признаков активации фолликулярного и паракортикального роста. При анализе препаратов селезенки, печени и сердца какой-либо патологии обнаружено не было. Сохранена нормальная структура селезенки без фолликулярной гиперплазии. Признаков токсической дистрофии гепатоцитов не выявлено. Миокард без лейкоцитарной инфильтрации, сохранена исчерченность миокардиоцитов. Данные результаты подтверждают отсутствие локального и системного токсического воздействия биологического протеза на организм.

Далее проведено изучение характеристик биологического сосудистого протеза после его имплантации в живой организм в остром эксперименте. Исследование проводилось на 2 половозрелых кроликах. Распределение по половому признаку: 1 особь мужского пола и 1 - женского. Средняя масса составила 4000 гр.

Для выполнения оперативных вмешательств проводилась комбинированная анестезия. Использовались препараты «Кетамин» для ввода в анестезию и «Пропофол» для поддержания анестезии. Инъекция кетамина выполнялась внутримышечно. Пропофол вводился внутривенно перфузором с постоянной скоростью через предварительно установленный венозный катетер.

Оперативные вмешательства проводились в стерильной операционной. После обработки операционного поля 70%-ным спиртовым раствором хлоргексидина выполнялась лапаротомия. Затем тупым и острым способом выделялся брюшной отдел аорты. После внутривенного введения гепарина выполнялось пережатие сосуда. Резецировался участок аорты и проводилось линейное протезирование удаленного сегмента биологическим протезом полипропиленовой нитью 8/0. После пуска кровотока анализировалось состояние швов, герметичность протеза, его проходимость, наличие стеноза проксимального и дистального анастомозов. Состояние швов, герметичность оценивали визуально. Проходимость протеза признавали удовлетворительной при отчетливой пульсации на бедренных артериях. Стеноз в области сформированного анастомоза фиксировали при наличии систолического дрожания в дистальной части аорты. Оценка функционирования протеза проводилась в течение 30 минут. Затем внутривенно вводилось 4 мл пропофола и достигалась биологическая смерть животного. Выполнялась резекция протеза, его рассечение и оценка тромбогенности.

У всех животных после пуска кровотока протез был полностью герметичным, не требующим дополнительного прошивания (рисунок 10).

Остальные характеристики биополимерного протеза представлены в таблице.

Преимуществами предложенного способа являются.

1. Герметичность - подтверждена отсутствием кровотечения из протеза и в области анастомозов в остром эксперименте.

2. Атромбогенность - подтверждена отсутствием тромбов в просвете протеза в остром эксперименте.

3. Стерильность - подтверждена на животных в хроническом эксперименте.

4. Отсутствие токсичности - подтверждено отсутствием как локальной, так и системной токсичности на животных в хроническом эксперименте.

5. Биологическая инертность - подтверждена с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, гистологическим методом и в хроническом эксперименте на животных.

6. Высокая прочность - подтверждена на этапе исследования физических свойств и прочностных характеристик.

7. Длительный срок хранения - на момент проведенных исследований протез сохранял свои свойства на протяжении 36 месяцев.

Предложенный способ и признаки, отличающие его от известных методик, в медицинской и патентной литературе не обнаружены.

Источники информации

1. Ивченко А.О., Шведов А.Н., Ивченко О.А. Сосудистые протезы, используемые при реконструктивных операциях на магистральных артериях нижних конечностей. Бюллетень сибирской медицины. 2017; 16 (1): 132-139.

2. Khaladj N., Pichlmaier U., Stachmann A., Peterss S., Reichelt A., Hagl C. et al. Cryopreserved human allografts (homografts) for the management of graft infections in the ascend-ing aortic position extending to the arch. Eur J Cardiothorac Surg. 2013;43:1170-1175.

3. Малиновский H.H., Константинов Б.А., Дземешкевич С.Л. Биологические протезы клапанов сердца. - М.: Медицина, 1988.

4. Hoprins R.A. Cardiac Reconstructions with Allograft Valves. - Springer-Verlag, 1990. - p. 44-46.

5. Гомографт сердечно-сосудистой системы (варианты), способ получения гомографта, среда для воздействия на ткани гомографта (варианты): пат. 2525197 Рос. Федерация / Болсуновский В.А., Болсуновский А.В. - 2013125373/14; заявл. 28.05.2013; опубл. 10.08.2014, Бюл. № 22.

6. Барбараш Л.С., Криковцов А.С., Журавлева И.Ю. Биологические протезы артерий. - Кемерово: 1996. - 208 с.

Изобретение относится к области медицины, в частности к сердечно-сосудистой хирургии. Предложен способ изготовления биологического сосудистого протеза, заключающийся в заборе и препаровке аутопсийного материала, антимикробной обработке, децеллюляризации и хранении протеза. Для антимикробной обработки используют однопроцентный раствор формальдегида. Децеллюляризацию и хранение проводят в растворе гексана чистого для анализа. Изобретение обеспечивает внедрение в клиническую практику способа изготовления биологического сосудистого протеза, который был бы герметичным, атромбогенным, стерильным, нетоксичным, иммунологически инертным к окружающим тканям, имел бы высокую прочность и длительный срок функционирования и хранения. 9 ил., 2 табл.

Способ изготовления биологического сосудистого протеза, заключающийся в заборе и препаровке аутопсийного материала, антимикробной обработке, децеллюляризации и хранении протеза и отличающийся использованием для антимикробной обработки однопроцентного раствора формальдегида при температуре плюс двадцать градусов Цельсия в течение семи дней, проведением децеллюляризации в растворе гексана чистого для анализа при температуре минус восемнадцать градусов Цельсия в течение четырнадцати дней и хранении в растворе гексана чистого для анализа.