СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИСНА-МЭДИ У ОВЕЦ Российский патент 1997 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, к диагностике инфекционных болезней животных и может быть использовано для диагностики висна-мэди у овец.

Висна вирусная безлихорадочная болезнь центральной нервной системы овец, характеризующаяся развитием атаксии, параличей и сопровождающаяся разрушением белого вещества головного мозга, мозжечка и демиелизацией нервных волокон (Sigurdsson, 1957).

Мэди медленно прогрессирующая интерстициальная пневмония овец. Возбудители висна-мэди вирусы, выделенные в 1957 году из мозга в культуре клеток сосудистого сплетения мозга (при висна) и легких (при мэди) больных овец. (H. Thormar, 1967). Физико-химические и биологические свойства возбудителя сходны с онкогенными РНК-содержащими вирусами. В естественных условиях болеют козы и овцы старше 2 лет. Процент пораженности возрастает с увеличением возраста. (M. Gudnattoir et al. 1968). Исход болезни летальный. Наибольший пик достигается через 10-15 лет после заноса возбудителя. Число пораженных может составлять 20-30 поголовья. Возбудитель выделяется из крови и различных органов: легких, селезенки, сосудистого сплетения головного мозга, медиастинальных лимфатических узлов (M. Gudnattoir et al. 1967, 1968) и церебральной жидкости. В крови вирус выявляется, начиная с первого месяца заражения и до гибели животного. У естественно инфицированных и экспериментально зараженных животных вирус в крови определяется за несколько месяцев (иногда более, чем за год) до выявления каких-либо патоморфологических изменений. Гистологические изменения обнаруживаются раньше, чем первые клинические признаки болезни. (M. Gudnattoir, 1968).

Глубокие поражения в легких и мозге, проявляющиеся клиническими симптомами болезни, могут наблюдаться как при высоком титре нейтрализующих антител в сыворотке, так и в их отсутствии. (H. Thornar et al. 1966; M. Gudnattoir, 1968). Вирус выделяется из крови несмотря на высокую концентрацию нейтрализующих антител.

Предварительный диагноз ставят на основании анализа эпизоотической обстановки, характерных клинических признаков, выявляемых при патологоанатомическом и патоморфологическом исследованиях, изменений в легких, мозгу, результатов исследования спинномозговой жидкости /1/.

Для выявления скрытых вирусоносителей и подтверждения диагноза у клинически больных применяют серологические реакции. Определяемый реакциями уровень антител у отдельных овец может быть обнаружен в разные сроки инфицирования. Антитела выявляют через несколько недель или несколько месяцев после заражения, но в исключительных случаях через 2 года и более /2/. У овец, инфицированных в естественных условиях, антитела, вероятно, продуцируются позднее, чем при экспериментальном заражении. Известно несколько серологических методов для определения антител к вирусу висна-мэди: реакция нейтрализации (PH), реакция связывания комплемента (PCK), иммуноферментный анализ (ИМФА), реакция диффузионной преципитации (РВП) /3/. При относительно высокой эффективности серологической диагностики (60-90) возможности ее применения ограничиваются тем, что у до 30 животных антитела не улавливаются. Это объясняется тем, что длительная персистенция вируса висна-мэди в присутствии антител приводит к антигенной изменчивости. (G. Georgason, 1978; Шуляк, 1984).

Известен способ диагностики висна-мэди у овец по индексу соотношения малых и больших лимфоцитов /4/. Этот способ доступен и может быть успешно использован как дополнение к серологическим исследованиям при проведении оздоровительных мероприятий, преимущественно в хозяйствах, неблагополучных по висна-мэди, и для экспресс-диагностики на поголовье овец при необходимости срочной проверки. К недостаткам способа можно отнести многоэтапность при учете и интерпретации результатов (измерение диаметра лимфоцитов; подсчет больших лимфоцитов; подсчет малых лимфоцитов; определение индекса соотношения больших и малых лимфоцитов).

Анализ технических решений, проведенный для определения уровня развития в области диагностики висна-мэди овец, выявил основную тенденцию - автоматизация, что обеспечивает точность диагностики из-за исключения возможных субъективных ошибок и высокую производительность при проведении массовых обследований животных.

Выявленная тенденция реализуется использованием современных технических средств, для чего необходим выбор соответствующих параметров патогенеза висна-мэди, фиксируемых приборами.

Нами проведены предварительные исследования по изучению морфологической картины крови овец, инфицированных и неинфицированных вирусом висна-мэди. Инфицированность овец вирусом висна-мэди определяли в РДП антигеном к вирусу висна-мэди, изготовленным научным отделом НИВИ НЗ РФ (г. Йошкар-Ола) серия N 6, 17.06.93 г. Исследования показали, что гематологические показатели у инфицированных и неинфицированных овец не имели достоверных различий за исключением субпопуляций лимфоцитов малых размеров (≅9 мкн), процент которых у инфицированных овец достоверно снижался.

Предлагается способ диагностики висна-мэди у овец на основе выявленного параметра снижения субпопуляции лимфоцитов малых размеров (≅9 мкн), точность и упрощение которого обеспечиваются использованием гематологического анализатора System 9000 Ditt. Модель Serino-Diagnostica Inc.

Выбор этого прибора для морфологических исследований крови не является случайным. Прибор представляет собой полностью автоматизированный 18-параметрический гематологический счетчик клеток, используемый для in vitro анализа клеток крови. Производительность прибора составляет 60 образцов в час. Продолжительность одного анализа включает время загрузки, время собственно анализа и время распечатки результатов исследований. Принцип работы системы электронного счета и определения размеров основан на разнице проводимости клеток крови и жидкости, в которой они содержатся. Для выделения эритроцитов и тромбоцитов используется электронная схема сортировки импульсов. Выводимая кривая распределения лейкоцитов по размерам рассчитывается на основе всего подсчитанного количества лейкоцитов крови. Лейкоциты дифференцируются на три группы: лимфоциты, моноциты с эозинофилами и базофилами и гранулоциты, т.е. нейтрофилы. Характеристика указанных групп обеспечивается фиксированными дискриминаторами L₁, L₂, L₃, L₄.

Дискриминатор L₁ указывает процент клеток в нижней области зоны лимфоцитов. Дискриминатор L₂ указывает процент клеток между пиками лимфоцитов и моноцитов с эозинофилами. Дискриминатор L₃ указывает процент клеток между пиками лимфоцитов и моноцитов с эозинофилами. Дискриминатор L₄ указывает процент клеток в верхней части кривой популяции нейтрофилов.

В табл. 1 приведены результаты морфологических исследований крови инфицированных и неинфицированных вирусом висна-мэди овец, проведенных на гематологическом анализаторе, причем с учетом результатов предварительных исследований определяли количество лимфоцитов в зависимости от размеров.

Из табл. 1 видно, что у инфицированных вирусом висна-мэди овец по сравнению с неинфицированными вирусом висна-мэди овцами происходит достоверное снижение субпопуляций лейкоцитов, дифференцируемых дискриминаторами
Способ осуществляется следующим образом.

Кровь из яремной вены исследуют на гематологическом анализаторе System-9000 по программе анализа лейкоцитов. На гистограмме учитывают показания дискриминаторов L₁ и L₂ и при величине L₁ 0-1,2 и величине L₂ 21,9 диагностируют висна-мэди.

Пример 1. У овцы N 321 из яремной вены берут кровь. 0,5 мл с антикоагулянтом триланон-6 микропипеткой заправляют в специальную кювету и включают программу анализа лейкоцитов. На гистограмме учитывают показания дискриминаторов L₁ и L₂, которые составляют соответственно 1,7 и 29,7 Животное здоровое. Диагноз подтвержден в реакции диффузионной преципитации с антигеном к вирусу висна-мэди производства ВИЭВ.

Пример 2. В совхозе фирмы "Родина" Шахунского района Нижегородской области проводят морфологические исследования крови на гематологическом анализаторе System-9000, как в примере 1 и серологические исследования в РДП с антигеном к вирусу висна-мэди, изготовленным научным отделом НИВИ НЗ РФ (г. Йошкар-Ола) серия N 6, 17.06.93 г. Результаты представлены в табл. 2.

Пример 3. Определяют точность способа в сравнении с известными. РДП ставят с антигеном к вирусу висна-мэди производства ВИЭВ. Гематологический способ: в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимза, подсчитывают количество лимфоцитов. Диаметр измеряют окулярмикрометром МОВ-1-15х. Морфологические исследования проводят, как в примере 1. Результаты представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, все три способа обладают одинаковой точностью, совпадающие результаты зарегистрированы во всех случаях, т.е. отмечена полная корреляция, что позволяет использовать предлагаемый способ для обследования животных в хозяйствах, подозрительных на неблагополучие по висна-мэди, для своевременного принятия мер по предупреждению распространения инфекции.

Использование: ветеринария. Сущность изобретения: кровь исследуют на гематологическом анализаторе. На гистограмме учитывают показания дискриминаторов. Диагноз на висна-мэди может быть поставлен при следующем содержании лимфоцитов: лимфоциты ≅7 мкм от 0 до 1,2 % и лимфоциты от ≥7 мкм до ≅9 мкм ≅ 21,9 %. 3 табл.

Способ диагностики висна-мэди у овец путем исследования форменных элементов крови, отличающийся тем, что определяют содержание малых и частично средних лимфоцитов и при содержании малых лимфоцитов размером не более 7 мкм 0 1,2% и средних лимфоцитов размером 7 9 мкм 21,9% диагностируют висна-мэди у овец.