СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2017 года по МПК G01N33/49 G01N33/53 G01N33/531 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной вирусологии и иммунологии, и может быть использовано для выявления животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы с необратимым процессом, возбудителем которой является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). ВЛКРС оказывает депрессивное действие на организм вследствие генетического паразитизма в В-лимфоцитах, поражения других иммунокомпетентных клеток, органов иммунной системы и хронического стрессового воздействия. Заражение животных ВЛКРС сопровождается выработкой антител к структурным белкам вируса. Антитела и вирус циркулируют в организме у зараженных животных на протяжении всей жизни.

Для установления лейкозной инфекции узаконено серологическое исследование с применением реакции иммунодиффузии (РИД). РИД основана на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Положительные РИД-реакции регистрируются у животных с уровнем вирусспецифических антител в ИФА выше 41 ME [1]. На чувствительность РИД влияет ряд факторов, в частности инкубационный период болезни, продолжительность которого может быть 60-90 дней, иммунологическая толерантность (индуцированное отсутствие иммунного ответа на конкретный антиген при сохранении иммунореактивности на прочие антигены), вторичные иммунодефициты, обусловленные пред- и послеродовым периодом у коров, некоторыми инфекционными и инвазионными болезнями, применением живых вакцин и экологически неблагоприятными факторами окружающей среды. Кроме того, у 20-30% серопозитивных животных отмечается «выпадение» РИД при микроремиссиях, так как антиген ВЛКРС связывается с антителами в иммунные комплексы.

В случае персистентных вирусных инфекций искусственное нарушение равновесия между возбудителем и иммунитетом обеспечивает выявление инфицированных животных в скрытом периоде [2].

Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота провокацией иммунного ответа, включающий серологическое исследование сыворотки крови в РИД с повторным серологическим исследованием крови серо-негативных животных после трехкратного введения инактивированной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота с интервалом в 14 дней [3]. Но при сложности осуществления известный способ недостаточно эффективен, что обусловлено строго индивидуальным действием вакцины на фоне вторичных иммунодефицитов.

В качестве предпочтительного аналога нами рассматривается способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота провокацией иммунного ответа туберкулиновой пробой, включающий серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применением РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на туберкулин при проведении диагностических аллергических исследований на туберкулез [4]. Внутрикожное введение ПДЦ туберкулина для млекопитающих с целью диагностики туберкулеза крупного рогатого скота активизирует синтез антител к gp51 антигену вируса лейкоза, но этот процесс зависит от состояния иммунной системы - инфицирование организма ВЛКРС приводит к нарушению регулирования иммунной системы хозяина как на клеточном (поражение В-лимфоцитов, части Т-лимфоцитов, моноцитов), так и на гуморальном уровне (дефицит IgM и IgA) [5].

Цель изобретения - повышение эффективности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Поставленная цель достигается провокацией туберкулиной пробой, причем ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл левамизола на 1 млн. ME.

Левамизол (Levamisolum) - 2,3,5,6-тетрагидро-6-фенилимида-зо-[2,1-b]-тиазола гидрохлорид, высокоэффективный антгельминтик, используемый при желудочно-кишечных и легочных нематодозах. При изучении антигель-минтного действия левамизола было обнаружено, что он повышает общую сопротивляемость организма и может быть использован как средство для иммунотерапии. Опыты на изолированных клетках и наблюдения за здоровыми и больными животными показали, что препарат способен восстановить измененные функции Т-лимфоцитов и фагоцитов и вследствие его тимомиметического эффекта может регулировать клеточные механизмы иммунологической системы. Более подробные исследования показали, что левамизол, избирательно стимулируя регуляторную функции Т-лимфоцитов, может выполнять функции иммуномодулятора, способного усилить слабую реакцию клеточного иммунитета, ослаблять сильную и не действовать на нормальную реакцию. В связи с этими свойствами левамизол был предложен для лечения различных заболеваний, в патогенезе которых придают значение расстройствам иммуногенеза: первичные и вторичные иммунодефицитные состояния, аутоиммунные болезни, хронические и рецидивирующие инфекции, опухоли и др. Так, введение телкам подкожно левамизола в дозе 2, 5 мг/кг живой массы трехкратно с интервалом в 14 дней способствовало снижению уровня инфицированности ВЛКРС у опытных животных через 18 месяцев по сравнению с контрольными (17, 6% - опытная группа, 23, 1% - контрольная группа) [6]. Левамизол как иммуностимулирующий препарат может быть эффективен в комплексной терапии различных заболеваний [7]. Препарат вызывает увеличение числа как Т-, так и В-лимфоцитов, титр естественных антител и процесс антителообразования у интактных животных. Полученные данные показали, что левамизол у интактных животных в основном стимулирует клеточный иммунитет. Он вызывает быстрый эффект: уже через сутки количество Т-лимфоцитов увеличивается в 2 раза по сравнению с контрольными животными. У спонтанно зараженных в эти же дни левамизол в дозе 10 мг/кг по АДВ вызывал повышение уровня Т-лимфоцитов в 5 раз. Возрастающая активность Т-лимфоцитов, наступающая под действием левамизола, очевидно, играет немаловажную роль в способности препарата повышать иммунобиологические свойства организма [7].

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. В хозяйстве, благополучном по туберкулезу, но неблагоприятном по лейкозу, формировали три группы животных (потомство от сероположительных коров-матерей): 2 группы - опытные, 1 группа - контрольная. Серологическую диагностику на лейкозную инфекцию в опытных группах проводили после аллергического исследования животных на ППД-туберкулин для млекопитающих, причем животным первой опытной группы вводили ППД-туберкулин для млекопитающих, разведенный 10%-ным раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME. Учет результатов проводили в первые 5 дней после учета и оценки реакции на туберкулин. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, провокация туберкулиновой пробой позволила повысить выявляемость серопозитивных животных, причем процент выявляемости был значительно выше в первой опытной группе - на 6, 7% по сравнению со второй опытной группой и на 20, 0% по сравнению с контролем.

Пример 2. Исследовали сыворотки крови, отобранные у животных, обработанных, как в примере 1, через 5 дней после введения ППД-туберкулина для млекопитающих для определения уровня вирусспецифических антител иммуноферментным методом с применением ИФА-набором (вариант VeriT-est, НПО НАРВАК). Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, туберкулиновая проба активизировала синтез вирусспецифических антител, причем более высокий уровень вирусспецифических антител отмечали в первой опытной группе.

Пример 3. Для экспериментальных исследований были отобраны 2 хозяйства, благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота. В результате изучения эпизоотической ситуации по инфекции ВЛКРС в первом хозяйстве было установлено, что первичная инфицированность коров составила 1%, эти животные были изолированы от общего стада. Для хозяйства были разработаны мероприятия, своевременное проведение которых способствовало формированию свободного от лейкоза стада в короткие сроки, где было предусмотрено проведение последующих с интервалом в три месяца серологических исследований на лейкоз сразу же после аллергических исследований на туберкулез. Реагирующих на ППД - туберкулин млекопитающих животных не выявлено, а количество животных-носителей ВЛКРС возросло. В этом варианте второе и третье исследование животных в РИД позволило выявить большое число животных-носителей ВЛКРС. Последующими исследованиями было выявлено незначительное количество инфицированных вирусом лейкоза коров, их полная своевременная изоляция способствовала скорейшему оздоровлению маточного стада от лейкозной инфекции. Во втором хозяйстве первое и все последующие серологические исследования на лейкоз с интервалом в три месяца проводили после проведения аллергических исследований на туберкулез, причем ППД-туберкулин для млекопитающих разводили 10% раствором левамизола в соответствии с изобретением. Количество серопозитивных животных снижалось от исследования к исследованию. Все инфицированные коровы были выведены из основного стада. Благополучное по лейкозной инфекции стадо было получено в короткие сроки. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, в исследованных нами хозяйствах инфицированность коров вирусом лейкоза не достигала 10% и оздоровительные мероприятия проводились согласно «Правилам по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота" (Москва. 1999), которыми предусмотрена полная изоляция инфицированных ВЛКРС животных при сложившейся эпизоотической ситуации. Заявленный способ (второе хозяйство) обеспечил сокращение сроков выявления животных, инфицированных ВЛКРС, и количества серологических исследований.

Проведенные исследования показали, что заявленный способ позволяет повысить чувствительность серологического способа диагностики лейкоза с применением РИД благодаря повышению уровня вирусспецифических антител. Способ прост в осуществлении, повышает чувствительность прижизненной диагностики лейкоза с применением РИД, своевременно выявляет животных с недостаточным уровнем вирусспецифических антител, повышает эффективность оздоровительных мероприятий, тем самым сокращая срок нахождения в стаде инфицированных животных, снижая напряженность эпизоотической ситуации по лейкозу.

Источники информации

1. Иванов, О.В. Эффективность серологических методов исследования при лейкозе крупного рогатого скота/О.В. Иванов, О.Ю. Иванова, В.П. Федотов// Ветеринария - 2008. - № 7. - С. 26-29.

2. Макаров, В.В. Иммунологическая концепция персистентных вирусных инфекций/ В.В. Макаров//Проблемы ветеринарной иммунологии: Научн. Тр. ВАСХНИЛ. - М.:Агропромиздат, 1990. - С. 128-132.

3. Патент РФ №2264628 G01N 33/53, 2005.

4. Разумовская, В.В. Выявление животных с латентной инфекцией ВЛКРС методом провокации туберкулиновой пробой/В.В.Разумовская //Научные основы профилактики и лечения болезней животных: Сб. научн. тр. ведущих ученых России, СНГ и др. стран. - Екатеринбург, 2005. - С. 104-110.

5. Иванов, О.В. Качество серологической диагностики - гарантия оздоровления стада от лейкоза крупного рогатого скота/О.В. Иванов, О.Ю. Иванова // Научно-практический журнал Farm animals - 2014. - № 3. - С. 26-29.

6. Никитенко, A.M. Профилактика инфицированная телят ВЛКРС с помощью левамизола/А.М. Никитенко//Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота: докл. Всесозн. конф., Новосибирск, 11-13 апр., 1990. - Новосибирск, 1990. - С. 78-80.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2-х томах. Т. 2. - 11-е изд. стер. - М.: Медицина, 1988. - 576 с.

8. Даугалиева Э.Х. Филиппов В.В. Иммунный статус и пути его коррекции при гельминтозах сельскохозяйственных животных. - М.: ВО «Агро-промиздат». - 1991. - 188 с.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих. При этом ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME. Использование заявленного изобретения обеспечивает повышение чувствительности серологического способа диагностики лейкоза с применением РИД благодаря повышению уровня вирусспецифических антител. 3 табл., 3 пр.

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применением РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих при проведении диагностических аллергических исследований на туберкулез, отличающийся тем, что ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME.