СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК C05F11/08 

Изобретение относится к области технической микробиологии и сельскому хозяйству, в частности к способам получения бактериальных удобрений, используемых при выращивании овощных культур, а именно для повышения урожайности картофеля.

Известен способ получения бактериального удобрения путем смешивания бактериальной культуры с торфом (авт.свид. N 477150, СССР, C 05 11/08, 1975).

Недостатком данного способа являются большие энергозатраты, быстрая гибель бактериальных клеток из-за отсутствия в торфе питательных веществ.

Известен также способ получения бактериального удобрения, включающий выращивание бактериальной культуры азотфиксирующих микроорганизмов на питательной среде с последующим концентрированием, сушкой биомассы и перемешиванием с наполнителем (Доросинский Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Колос, 1970).

Недостатком этого способа является недостаточно высокая способность нарастания титра, что снижает азотфиксирующую способность удобрения.

Наиболее близким к предлагаемому и выбранным в качестве прототипа является способ получения бактериального удобрения путем внесения бактериальной культуры Azotobacter chroococcum штамм 53 в торфонавозный компост (Доросинский Л.М. Бактериальные удобрения дополнительное средство повышения урожая. М. Россельхозиздат, 1965).

К недостаткам данного способа относятся высокая требовательность бактериальной культуры к pH, температуре, влажности и сравнительно высокая норма расхода торфонавозного компоста 10 т/га.

Целью изобретения являются повышение эффективности бактериального удобрения за счет увеличения его азотфиксирующей способности и снижения нормы его расхода при внесении.

Указанная цель достигается тем, что в торфонавозный компост вносят азотфиксирующую культуру Pseudomonas fluorescens 15 ВСХМ-478 и смесь инкубируют при периодическом перемешивании в течение 3-5 суток.

Бактериальный штамм ассоциативного азотфиксатора Pseudomonas fluorescens 15 выделен из болотного мха сфагнума. Согласно определителю Бердже бактерии в форме палочки с закругленными концами. Подвижны, обладают полярными жгутиками. Грам-отрицальные. Продуцируют зеленый пигмент (растворимый), аэроб, факультативный.

Колонии на агаре: круглые, приподнятые, гладкие, аморфные, цельные с флуоресцирующим ореолом вокруг колонии.

Бульон: помутнение, флуоресценция.

Косой агар: сплошной, желтовато-зеленый налет; флуоресцирует.

Картофель: нежный, от серого до коричневого цвета слизистый налет, мацерация.

Культура обладает запахом триметиламина. Индол не образуется. Оптимум температуры 26^oC.

Идентификация штамма (по определению Н.А.Красильникова, М. 1949) следующая:
Образование пигментов образует слабый желто-зеленый пигмент на среде Кинга; на МПА колошении светло-бежевого цвета
Тирозиназа не имеется
Оксидаза по Ковачу имеется
Желатиназа не имеется
Рост при температуре минимальная +4^oC; максимальная +41^oC; оптимальная +26^oC
Денитрификация активно
Ассимилируют углеводы глюкоза, сахароза, галактоза, арабиноза, манноза, фруктоза, мальтоза и целлобиоза (слабо)
Не ассимилирует углеводы лактоза, ксилоза, трегалоза, рамноза, сорбоза, рекаприн, крахмал
Ассимилирует органические кислоты винная, яблочная, янтарная, лимонная, молочная, пировиноградная, цис-аконитовая, фумаровая, глутаровая, альфа-кетоглутаровая, щавелевоуксусная, мочевая
Не ассимилирует органические кислоты уксусная, щавелевая, масляная, пропионовая, валерьяновая, антраниловая
Ассимилирует спирты этанол, пропанол, глицерин, маннит, метанол (слабо)
Не ассимилирует спирты дульцит, сорбит, поливиниловый спирт
Не ассимилирует другие источники углерода углеводороды, масла, пектиновые вещества, этиленгликоль, индолилуксусная кислота (соли)
ассимилирует источники азота аммонийные, нитраты, мочевина все аминокислоты, кроме триптофана и цистеина
Ассимилирует ароматические соединения бензойная, фенилуксусная, н-оксибензойная, коричная, таннин, резорцин, галловая и фенол слабо
Не ассимилирует ароматические соединения о-оксибензойная, м-оксибензойная, пирокатехин, гидрохинон, пирогаллол, флороглюцин
Штамм выращивается и поддерживается на среде Кинга Б с пересевом 1 раз в 3 месяца. Хранится также на бидистиллированной воде при 4-6^oC с пересевом 1 раз в год. Штамм депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под регистрационным номером 478.

Способ осуществляется следующим образом.

Выращивают культуру Pseudomonas fluorescens 15 в жидкой среде Кинга Б (пептон 20, глицерин 10, MgSO₄•7H₂O 0,2; KH₂PO₄ 0,2 г/л) на качалке или в ферментере в течение 24-26 часов при температуре 26-30^oС; в ферментере коэффициент заполнения 0,6, подача воздуха 1 об/об/мин. мешалка непрерывно. Получают культуру с титром 19-20•10⁹ клеток/мл. Жидкая культура пригодна для использования в течение 10 дней, если ее хранить при температуре 6-8^oС. В том случае, если посевной материал предназначен для длительного хранения (6 месяцев), готовят торфяной инокулянт путем смешивания ферментационной жидкости с гамма-стерильным торфом, обогащенным 1% глицерином (по способу, описанному в авт.свид. N 922104, C 05 11/08, 1979). Титр торфяного инокулянта не ниже 15•10⁹ кл/г. Смешивание жидкой культуры штамма с торфонавозным компостом производят вручную или с помощью соответствующих механизмов таким образом, чтобы исходный титр бактерий составлял 1,5-2,0 • 10⁸ кл/г смеси. Указанная исходная концентрация клеток достаточна для получения высокого титра в целевом продукте, что иллюстрируется следующими данными, представленными в таблице 1.

В случае, если для инокуляции торфонавозного компоста используют торфяную культуру, сохраняют ту же норму инокуляции по титру, как и в жидкой культуре; в торфяном инокулянте предварительно определяют титр бактерий и рассчитывают необходимое количество посевного материала так, чтобы исходный титр составлял 1,5 2,0 • 10⁸ кл/г в инокулитрованном торфонавозном компосте.

Продолжительность инкубации инокулированного торфонавозного компоста при стандартной температуре 18-20^oC, как видно из таблицы 2, ограничивается 3-5 сутками.

Способ получения бактериального удобрения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру Pseudomonas fluorescens 15 выращивают в жидкой питательной среде Кинга Б, г/л: глицерин 10,0; пентон 2,0; 7H₂O 0,2; KH₂PO₄ 0,2 на качалке в бутылях или в ферментере с постоянной подачей стерильного воздуха 1 об/об/мин и перемешиванием; ферментацию ведут при температуре 28^oC в течение 40-48 часов; получают культуру с титром 20,0 • 10⁹ кл/мл. Жидкий инокулюм хранят при 4-8^oC не более 10 дней. К 1 тонне торфонавозного компоста прибавляют при постоянном перемешивании 10 литров ферментационной жидкости и получают исходный титр 2 • 10⁸ мл/г. В закрытом от солнечных лучей помещении смесь выдерживают при температуре 20^oC 3 суток или при температуре 15-18^oC - 5 суток, периодически перемешивания (2 раза в день). Бактериальное удобрение считается готовым, если титр бактерий достигает 2,5 • 10⁹ кл/г.

Пример 2. Получают жидкий инокулюм, как описано в примере 1. В полиэтиленовые пакеты, размером 20х30 см, помещают 240 г торфонавозного компоста и подвергают гамма-стерилизации дозой 2,5 Мегарад. Инъекцией в пакет вводят 60 мл жидкого инокулюма Pseudomonas fluorescens 15, отверстие заклеивают липкой лентой, перемешивают и инкубируют 5 суток при температуре 20^oC. Получают препарат, содержащий не менее 10•10⁹ кл/г, который хранят при температуре 10-12^oC до 6 месяцев (срок годности) и используют в качестве посевного материала при производстве бактериального удобрения. 3 кг инокулюма из пакетов равномерно смешивают с 1 тонной торфонавозного компоста и выдерживают 5 суток с периодическим перемешиванием (2 раза в день). В некоторых случаях 3 кг инокулюма предпочтительно суспедировать в 40-60 л чистой воды с последующим смешиванием суспензии с торфонавозным компостом.

Предлагаемый способ достаточно прост и может быть осуществлен с помощью стандартного сельскохозяйственного и микробиологического оборудования; не требует существенных капитальных затрат.

Проверка нового бактериального удобрения в течение 3-х лет в различных климатических зонах показала его высокую биологическую и хозяйственную эффективность.

В таблице 3 представлены сравнительные данные, полученные при выращивании картофеля с использованием нового и известных удобрений.

Для предпосадочной инокуляции клубней картофеля используют следующие способы:
а) обработка клубней бактериальным удобрением;
б) внесение в лунку или борозду удобрения с раскладкой клубней с последующей их засыпкой;
в) опрыскивание посадочного материала клубней суспензией бактериального удобрения.

Все эти способы обработки дают приблизительно одинаковые результаты.

Использование: техническая микробиология, сельское хозяйство и касается производства бактериальных удобрений. Сущность изобретения: в торфо-навозный компост вносят штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВСХМ-478, полученную смесь инкубируют при перемешивании в течение 3-5 суток. 4 табл.

Способ получения бактериального удобрения, включающий внесение азотфиксирующих бактерий в торфонавозный компост и инкубирование смеси, отличающийся тем, что из азотфиксирующих бактерий используют штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВСХМ 478, а инкубирование осуществляют в течение 3 - 5 сут при периодическом перемешивании.