ШТАММ БАКТЕРИЙ RHIZOBIUM SP.(ONONIS) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УДОБРЕНИЯ ПОД СТАЛЬНИК Российский патент 1994 года по МПК C12N1/20 C05F11/08 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур.

Стальник полевой Anоnis arvensis - ценная лекарственная бобовая культура, богатая алкалоидами, особенно много их в корнях растения. Настойку корней используют как кровоостанавливающее средство при геморрое, стальник также входит в лекарственный сбор для снижения сахара в крови при диабете. Природные популяции стальника незначительны, а потребности в сырье велики, поэтому его в последние годы интенсивно вводят в культуру, занимая им все большие площади в хозяйствах, занимающихся выращиванием лекарственных растений.

Важнейшей биологической особенностью стальника, как и всех бобовых культур, является его способность использовать атмосферный азот в симбиозе с клубеньковым бактериями, благодаря чему значительную часть потребности в этом элементе он может удовлетворить за счет биологической азотфиксации. Однако при расширении посевных площадей под стальником, когда он впервые засевается в севообороте, происходит только незначительное инфицирование его корней природной популяцией клубеньковых бактерий, в связи с чем растения лишь частично реализуют свой природный азотфиксирующий потенциал. Для получения высоких урожаев в этих условиях необходимо применять минеральные азотные удобрения, что негативно влияет как на себестоимость продукции, так и на качество лекарственного сырья и экологическую обстановку.

Вместе с тем известно, что одним из резервуаров повышения продуктивности бобовых культур, в том числе и стальника, может служить усиление у них процесса биологической азотфиксации путем обработки семян селекционными штаммами клубеньковых бактерий. Однако, до настоящего времени активных и специфичных штаммов клубеньковых бактерий для усиления симбиотической азотфиксации у стальника не было предложено.

Стальник полевой по своему систематическому положению относится к трибе клеверных, куда входит также и люцерна. Поэтому исследовали способность штаммов клубеньковых бактерий клевера, штамм 1326 (348а) и люцерны, штамм 1723 (425а) образовывать клубеньки на корнях растений стальника. Оказалось, что ни один из проверенных штаммов не был вирулентен по отношению к стальнику.

Целью изобретения является получение штамма Rhizobium sp (Ononis) активного азотфиксирующего микросимбионита стальника для усиления процесса симбиотической азотфиксации и повышения продуктивности этой культуры.

В качестве такого штамма предлагается штамм ВНИИСХМ 3502 клубеньковых бактерий стальника.

Штамм 3502 был выделен из клубеньков растений стальника местной популяции, произраставшей на черноземе на Украинской зональной станции лекарственных растений Всесоюзного института лекарственных растений (Полтавская обл. ).

Штамм идентифицирован по определителю Берги.

Штамм Rhizobium sp. (Ononis) 3502 депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 3502 (индекс коллекции во Всемирном каталоге коллекций Rhizobium - СIАМ).

Штамм 3502 растет на питательных средах следующего состава:
1. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза 20,0; араг-агар 20,0, рН среды 6,8-7,0.

2. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; К₂НРО₄ 0,5; MgSO₄ x 7 H₂O 0,2; NaCl 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар-агар 15,0, рН среды 6,8-7,0.

Морфолого-культуральные свойства. Бактерии штамма 3502 грамотрицательные, имеют форму мелких палочек с закругленными концами, подвижные. Величина клеток пятисуточной культуры на маннитно-дрожжевом агаре 2,4-3,6 х 0,7 - 0,8 мкм. Культура быстрорастущая.

Штрих на маннитно-дрожжевом агаре обильный, беловатый, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 5 сут., однотипные, круглые, белые, выпуклые, слизистые, 1-2 мм в диаметре.

Штрих на бобовом агаре обильный, беловатый, слизистый. Колонии появляются на 5 сут., однотипные, белые, круглые, выпуклые, слизистые, 1-2 мм в диаметре.

Физиолого-биохимические свойства.

Симбионит. Макросимбионит - бобовое растение стальник.

Отношение к:
а) кислороду - аэроб; б) Т максимальная 36^оС; минимальная 4^оС, оптимальная 26-28^оС; в) рН максимальный 7,5, минимальный 6,0, оптимальный 6,8-7,0. Источники углерода
g e Глюкоза А_К (-) Лактоза А_К (-) Мальтоза А_К (-) Сахароза А_К (-) Арабиноза А_К (-) Рамноза А_К (-) Галактоза А_К (-) Дульцит А_К (-) Сорбит А_К (-) Маннит А_К (-) Ксилоза - Клетчатка - Крахмал -
Источники азота NaNO₃ + (NH₄)₂SO₄ + МПА -
Азот фиксирует в симбиозе со стальником.

Друге характерные физиологические особенности.

Желатину не разжижает.

Молоко с лакмусом не пепонизирует, окраску лакмусового молока не изменяет, вызывает образование слизистой зоны. При 1,5% NaCl в среде рост бактерий ингибируется, при 2% NaCl в среде не растет.

Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен.

Штамм 3502 хранится на гороховом агаре указанного выше состава и пересевается 1 раз в 6 месяцев при хранении при 4^оС.

Примеры осуществления изобретения
Оценку симбиотических свойств штамма 3502 - вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза проводили в условиях микровегетационных и вегетационных опытов.

Вирулентность определяли по количеству и качеству клубеньков, образованных на корнях стальникам при инокуляции его клубеньковыми бактериями в условиях микровегетационного опыта.

Азотфиксирующую активность определяли по величине ацетиленредуктазной активности на интактных клубеньках.

Эффективность симбиотической азотфиксации определяли по общему накоплению азота растениями на сосуд. Этот показатель складывается из величины урожая зеленой массы растений стальника и содержания в них азота, который определяли с помощью системы Къельтекс-авто, Текатор (Швеция).

П р и м е р 1. Микровегетационный опыт.

В большие пробирки (200 х 20 мм) добавляют 12 мл агаризованной среды Красильникова-Кореняко, г/л: K₂HPO₄ 1,0; MgSO₄ x 7 H₂O 1,0; Ca₃(PO₄)₂ 0,2; FeSO₄ следы; смесь микроэлементов по М.В. Федорову 1 мл. Состав раствора микроэлементов, г/л: H₃BO₃ 0,05; (NH₄)₂MoO₄ 0,05; KCl 0,005; NaBr 0,005; ZnSO₄ x 7 Н₂О 0,003; Al₂(SO₄)₃ x 7 H₂O 0,003; MnSO₄ 0,002.

Пробирки со средой стерилизовали в автоклаве.

Семена стальника скарифицировали в наждачной бумаге, затем стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 12 мин, после чего обильно промывали стерильной водой и раскладывали на увлажненные стерильные бумажные фильтры в чашки Петри для прорастания. Через 3 сут проростки в асептических условиях раскладывали по 2 в пробирки со средой. Опыты ставили в шестикратной повторности.

Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивали на косяках с бобовым агаром указанного состава в течение 3 сут. при 28^оС и суспендировали в растворе микроэлементов. На следующие сутки после раскладки семян в каждую пробирку вносили по 1 мл инокулюма, содержащего 10⁷ клеток. Растения выращивали в фитотроне при 18-22^оС в течение 6 недель. По окончании периода вегетации ватно-марлевые пробки у пробирок заменяли герметичными резиновыми колпачками, через которые вводили по 5 мл ацетилена в каждую пробирку. Через 3 сутки определяли прижизненную ацетиленредуктазную активность на газовом хроматографе "Цвет-100". Величину нитрогеназной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую активность штамма, выражают в микромолях C₂H₄ за 1/сут. на 2 растения. Результаты представлены в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что штамм 3502 вирулентен на стальнике; он образует на его корнях типичные для этого растения клубеньки. Изученные штаммы клубеньковых бактерий люцерны и клевера невирулентны на этом бобовом растении. Штамм 3502 является активным азотфиксирующим микросимбионтом стальника, на что указывает высокая ацетиленредуктазная активность.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что растения стальника способны вступать в эффективный симбиоз только со специфическими штаммами клубеньковых бактерий, поэтому в дальнейших опытах неспецифичные штаммы не использовались.

П р и м е р 2. Вегетационный опыт на песке.

Опыт проводили на нестерильном речном песке в шестикилограммовых сосудах в четырехкратной повторности. Соли вносили по Прянишникову, г/кг песка: KCl 0,15; MgSO₄ x 7 H₂O 0,06; CaHPO₄ 0,172; MnSO₄ 0,003; борная кислота 0,008; (NH₄)₂MoO₄ 0,001; NH₄NO₃ 0,24 (0,2 от полной нормы азота). Обработка семян перед посадкой такая же, как и для микровегетационного опыта.

Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивали на качалке в бобовом отваре при 28^оС в течение 3 сут. Выросшую суспензию наносили на семена стальника, разложенные в лунки, сделанные в песке каждого сосуда. В каждый сосуд вносили 20 мл суспензии титром 5 х 10⁷ клеток.

Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, штамм 3502 вступает в эффективный симбиоз со стальником, усиливает у него процесс симбиотической азотфиксации, благодаря чему значительно возрастают урожай зеленой массы растений, содержание азота и качество растительного сырья.

П р и м е р 3. Получение препарата на основе штамма 3502.

Приготовление жидкой посевной культуры. Жидкую культуру выращивают на качалке в качалочных колбах в течение 3 сут. на среде следующего состава, мас.%: гороховый отвар 10,0; сахар пищевой 0,5. рН после стерилизации 6,4 - 6,8. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин. Титр бактерий 4-5 млрд. клеток в 1 мл.

Для получения жидкой культуры штамм выращивают на скошенном бобовом агаре в течение 3 сут., выросшую массу клеток смывают стерильной водой и используют в качестве инокулюма. После микробиологического контроля культуральная жидкость из колб используется для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией культуральной жидкости из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,15-0,8 млрд./г торфа и влажности 45-60%. Затем содержимое в пакетах перемешивается. Ризоторфин хранят при 10-15^оС в темном помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для стальника на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, не растворимую в воде. Ризоторфин содержит 3-4 млрд. бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 месяцев со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную порцию семян.

П р и м е р 4. Использование ризоторфина для обработки семян стальника.

Эффективность симбиотической азотфиксации штамма 3502 определена также в вегетационном опыте на почве по величине урожая сухой зеленой массы и содержанию в ней азота.

Опыты закладывали на дерново-подзолистой почве в шестикилограммовых сосудах в четырехкратной повторности. Минеральные удобрения вносили по Прянишникову аналогично примеру 2. Добавляли азот в количестве 0,2 от нормы. Семена стальника стерилизовали аналогично примеру 2 обрабатывали ризоторфином, изготовленным на основе штамма 3502. Препарат вносили в дозе 200 г на гектарную порцию семян. Способ внесения препарата: 200 г ризоторфина разводят в 1 л водопроводной воды и, не давая отстаиватся, тщательно перемешивают для равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена в тот же день высевают во влажную почву.

В каждом сосуде оставляли по 10 проростков. Результаты опытов представлены в табл. 3.

Данные табл. 3 подтверждают, что штамм 3502 является высокоэффективным симбиотическим азотфиксатором. Улучшение азотного питания инокулированных растений стальника за счет более интенсивного поступления биологического азота оказывает положительное влияние как на урожай растений, так и на его качество.

Таким образом, штамм Rhizobium sp. (Ononis) 3502 существенно увеличивает азотфиксирующую способность стальника, повышает его урожай и улучшает качество урожая за счет увеличения в нем содержания белка. Это указывает на то, что штамм 3502 является активным азотфиксирующим микросимбионтом стальника и может быть использован для повышения урожая.

Использование: изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, получению средств повышения урожайности бобовых культур, в частности стальника, и касается нового штамма бактерий для получения вышеуказанного средства. Сущность изобретения: штамм бактерий Rhizobium sp (Ononis) выделен из клубеньков растений стальника. Депонирован в коллекции ВНИИСХМ под N 3502. Для получения удобрения штамм выращивают на среде, содержащей гороховый отвар и сахар, в течение 3 сут., затем полученную культуральную жидкость смешивают с торфом из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,15 - 0,8 млрд./г торфа и влажности 45 - 50% и хранят при температуре 10 - 15°С в темном месте. 3 табл.

Штамм бактерий Rhizobium sp. (Ononis) ВНИИСХМ 3502 для получения удобрения под стальник.