СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1997 года по МПК A23C19/04 G01N33/04 C12Q1/00 

Изобретение относится к мясной и молочной отраслям промышленности, биотехнологии производства молокосвертывающих ферментов и может быть использовано на заводах по производству ферментных препаратов и других организациях, производящих ферменты и контролирующих их качество.

В настоящее время для измерения активности промышленных партий молокосвертывающих препаратов и их стандартизации используют два способа (ТУ 10-02-824-89 Сычужный порошок; ТУ 10.02.851-90 Препарат ферментный ВНИИМС; ТУ 49 522-83 Пепсин пищевой куриный; ТУ 10.02.01.74-88 Пепсин пищевой овечий; ТУ 10.02.01.128-90 Пепсин пищевой говяжий НТ; ТУ 10.02.01.129-90 Пепсин пищевой говяжий). Первый из способов основан на сравнении времени свертывания молочно-ацетатной смеси раствором испытуемого препарата и очищенного свиного пепсина-эталона, при 25±1^oC. При этом ферментные препараты растворяют в 0,1 М ацетатном буфере с pH 5,30±0,05, а молочно-ацетатную смесь готовят смешиванием равных объемов пастеризованного молока и 1 М ацетатного буфера с pH 5,30±0,05. Массовую долю молокосвертывающих ферментов выражают в процентах свиного пепсина.

Недостатком способа является, во-первых, то, что он недостаточно точен, так как при pH 5,30±0,05 степень активации свиного пепсина в сравнении со значением активности при pH 6,5 значительно выше или является иной, чем для других ферментов, при том числе для говяжьего и куриного пепсинов, сычужного фермента. Во-вторых, низкий уровень стандартизации промышленных партий ферментных препаратов при использовании способа связан с тем, что для приготовления молочно-ацетатной смеси применяется молоко, отличающееся по химическому составу и биологическим свойствам. В этой связи конечные результаты определения массовой доли ферментов в препаратах по свиному пепсину являются неадекватными и практически невоспроизводимыми. Второй способ измерения активности молокосвертывающих препаратов, используемый в настоящее время в промышленности, основан на сравнении времени свертывания натурального коровьего молока испытуемыми ферментами, препаратами и стандартным образцом сычужного фермента. Недостатком способа является использование натурального молока, различающегося по химическому составу и биологическим свойствам, в том числе по содержанию белка, ионов кальция, органических кислот, величин титруемой и активной кислотности. Изменение значений этих факторов в большей степени влияют на пепсины, чем на сычужный фермент. В этой связи конечные результаты измерений величин активности препаратов различного ферментного состава по стандартному образцу сычужного фермента являются неадекватными и практически невоспроизводимыми в различных географических регионах или в различные сезоны года.

Для повышения уровня стандартизации промышленных партий молокосвертывающих ферментных препаратов целесообразно контролировать активность препаратов относительно стандартных образцов молокосвертывающих ферментов, входящих в состав препарата, с применением стандартизированного субстрата, поставляемого на все предприятия, производящие и потребляющие молокосвертывающие препараты.

Цель изобретения повышение точности измерений активности молокосвертывающих препаратов и повышение уровня их стандартизации.

Активность ферментных препаратов измеряется путем определения времени свертывания ими субстрата.

Цель достигается:
применением единого стандартизированного субстрата (ТУ 10.02.943-91);
измерением активности ферментных препаратов на водном растворе стандартизированного субстрата при концентрациях сухих веществ (11,0±1,0)% pH (6,5±0,1) ед. температуре (35,0±0,5)^oC;
измерением активности ферментных препаратов относительно стандартных образцов молокосвертывающих ферментов, входящих в состав препарата. (Стандартные образцы сычужного фермента, говяжьего и куриного пепсинов выпускаются в соответствии с отраслевыми инструкциями по их аттестации.)
Готовят 12%-ный раствор субстрата, pH 6,5. по 50 cм³ раствора субстрата помещают в стеклянные стаканчики, которые устанавливают в водный термостат при 35^oC.

В качестве контрольного субстрата используют натуральное коровье молоко с кислотностью (18±1^oT. По 50 см³ молока помещают в стеклянные стаканчики и устанавливают в водный термостат при 35^oC.

Готовят 1%-ные водные растворы стандартного образца сычужного фермента, стандартных образцов говяжьего и куриного пепсинов.

Готовят 1%-ные растворы промышленных партий говяжьего пепсина, куриного пепсина, сычужного порошка, препарата ВНИИМС (состав: 50% сычужного фермента и 50% говяжьего пепсина), препарата ВНИИМС ФП-2 "НТ" (состав: 25% сычужного фермента и 75% говяжьего пепсина), препарата ВНИИМС ФП-6 (состав: 50% говяжьего пепчина и 50% куриного пепсина), препарата ВНИИМС ФП-7 (состав: 50% сычужного фермента и 50% куриного пепсина).

Готовят смеси растворов стандартных образцов сычужного фермента, говяжьего и куриного пепсинов в соотношениях, отвечающих составу испытываемых ферментных препаратов.

В стаканы с подогретым в течение 15 мин до 35^oC натуральным молоком последовательно, с интервалом 60 с для двух параллельных определений, вносят по 0,5 см³ раствора стандартного образца (CO) сычужного фермента и также последовательно, с интервалом 60 с для двух параллельных определений, вносят по 0,5 см³ раствора испытываемого препарата сычужного порошка. Определяют продолжительность свертывания молока по секундомеру до появления хлопьев и расчитывают молокосвертывающую активность (А) исследуемого образца сычужного порошка по формуле:

где А₁ активность стандартного образца сычужного фермента, усл. ед;
T₁ продолжительность свертывания раствора субстрата стандартным образцом фермента, либо смесью стандартных образцов ферментов, с;
T₂ продолжительность свертывания раствора субстрата испытываемым препаратом, с.

В стаканы с подогретым в течение 15 мин до 35^oC раствором субстрата последовательно, с интервалом 60 с для двух параллельных определений, вносят по 0,5 см³ раствора стандартного образца сычужного порошка и соответственно по 0,5 см³ раствора препарата сычужного порошка. Определяют продолжительность свертывания раствора субстрата по секундомеру до появления хлопьев и расчитывают активность (А) исследуемого образца сычужного порошка с применением вышеуказанной формулы.

Аналогичные измерения активности препарата куриного пепсина провели относительно стандартного образца куриного пепсина, препарата говяжьего пепсина относительно стандартного образца говяжьего пепсина (см.табл. 1), препаратов ВНИИМС, ВНИИМС ФП-2, ФНИИМС ФП-6, ВНИИМС ФП-7, относительно стандартного образца сычужного фермента и относительно смесевых композиций стандартных образцов сычужного фермента, говяжьего и куриного пепсинов в соответствии с ферментным составом препаратов (см.табл. 2).

Как видно из табл. 1 и 2, предложенный способ повышает точность измерений активности молокосвертывающих препаратов (графы 5; 7) по сравнению с прототипом (графа 3) и обеспечивает повышение уровня стандартизации промышленных партий ферментов.

Использование: в молочной, мясной и биотехнологической промышленности при контроле качества ферментных препаратов. Сущность изобретения: субстрат сухой стандартизированный растворяют в дистиллированной воде с концентрацией сухих веществ 11,1±1,0% при pH 6,5±0,1 и температуре 35,0±0,5^oC. Полученный раствор свертывают раствором стандартного образца сычужного фермента или пепсина, или их смесевых композиций и раствором аналогичного по составу испытуемого ферментного препарата. Время свертывания сравнивают. 2 таб.

Способ измерения активности молокосвертывающих ферментов, заключающийся в сравнении продолжительности свертывания субстрата сухого стандартизованного, растворенного в дистиллированной воде с концентрацией сухих веществ (11,0 ± 1,0)% при рН 6,5 ± 0,1 и температуре (35,0 ± 0,5)^oС раствором стандартного образца сычужного фермента или пепсина, или их смесевых композиций и раствором аналогичного по составу испытуемого ферментного препарата.