СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КУРИНОГО ПЕПСИНА В МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩИХ ПРЕПАРАТАХ Российский патент 1997 года по МПК A23C19/02 G01N33/573 

Изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано в лабораториях заводов медицинских препаратов, организаций и предприятий, производящих молокосвертывающие препараты для сыроделия и контролирующих их качество.

В настоящее время в сыроделии используются комплексные молокосвертывающие препараты, разработанные на основе пепсинов. В указанных препаратах важно контролировать ферментный состав, нарушение которого приводит к снижению качества вырабатываемого сыра.

Известен способ определения количества куриного пепсина (а.с. СССР N 733164, опубл. 1980), сущность которого заключается в следующем: готовят 1% раствор препарата и 1% раствор куриного пепсина (эталона) на 1/15 Молярном фосфатном буфере, pH 7,4. По 10 мл этих растворов выдерживают в течение 5 мин при 43^oC. После охлаждения по 1 мл растворов вносят в две пробы молока по 50 мл каждая и определяют продолжительность свертывания молока известным способом. Содержание куриного пепсина в препарате рассчитывают, принимая активность эталона куриного пепсина за 100%
В последние годы в промышленность внедрены интенсивные технологии производства говяжьего и куриного пепсинов, что в значительной степени повлияло на физико-химические свойства пепсинов. Препараты характеризуются высокой буферной емкостью и низкими значениями величины pH их водных растворов.

По указанной причине в промышленных молокосвертывающих препаратах, вырабатываемых на основе говяжьего и куриного пепсинов интенсивных технологий, известный способ не обеспечивает получение объективных результатов (табл. 1).

Как видно из результатов, представленных в табл. 1, при фактическом содержании куриного пепсина в препарате 30% известный способ обнаруживает 44 50% а в препарате с 50% содержанием куриного пепсина способ обнаруживает 60 67%
Таким образом, основным недостатком известного способа является невозможность его использования для анализа состава молокосвертывающих препаратов, вырабатываемых на основе говяжьего и куриного пепсинов интенсивных технологий.

Целью настоящего изобретения является разработка способа определения количества куриного пепсина в смешанных препаратах с говяжьим пепсином с учетом физико-химических свойств препаратов, состава буфера, концентрации применяемого буфера и препарата, величины pH, температуры инактивации говяжьего пепсина.

Поставленная цель достигается следующим образом.

Готовят 2% раствор используемого молокосвертывающего препарата, содержащего говяжий и куриный пепсины, используя в качестве растворителя 0,2 М натрийкалийфосфатный буфер, pH 7,6.

В предварительно прогретые при температуре 46^oC пробирки, находящиеся в штативе ультратермостата, вносят по 5 мл раствора препарата (опыт) и выдерживают 5 мин. По истечении указанного времени пробирки вынимают, охлаждают до 20^oC. В качестве контрольных образцов используются исходные буферные растворы испытуемого препарата, не подвергавшиеся термообработке.

По 1 мл контрольного и опытного растворов испытуемого препарата вносят в образцы молока (субстрата) объемом 50 мл каждый, предварительно подогретые до температуры 35^oC в ультратермостате, и определяют продолжительность свертывания с момента внесения раствора препарата до момента появления хлопьев параказеина в образующейся пленке молока, периодически наносимого на стенки стаканчика стеклянной палочкой или шпателем.

Количество куриного пепсина в препарате рассчитывают по формуле (1):

где Х количество куриного пепсина в препарате,
Т₁ продолжительность свертывания 50 мл молока (субстрата) 1 мл контрольного препарата, мин.

Т₂ продолжительность свертывания 50 мл молока (субстрата) 1 мл опытного раствора препарата, термостатированного в течение 5 мин при температуре 46^oC, мин.

Пример 1.

Готовят 2% раствор промышленного молокосвертывающего препарата, содержащего в своем составе 30% куриного пепсина и 70% говяжьего пепсина (образец N 1) на 0,2 М натрий-калий фосфатном буфере, pH 7,6, который получают смешиванием 88,5 частей раствора, содержащего 35,601 г Na₂HPO₄ • 2H₂O в 1000 мл дистиллированной воды, с 11,5 частями раствора, содержащего 27,234 г КH₂PO₄ в 1000 мл дистиллированной воды.

Вносят по 5 мл буферного раствора препарата в четыре пробирки, две из которых находятся в штативе, помещенном в водяную баню с температурой 20^oC, две другие водном термостате с температурой 46^oC и выдерживают 5 мин, после чего опытные пробирки помещают для охлаждения в водяную баню с температурой 20^oC.

По 1 мл контрольного и опытного растворов препарата вносят в образцы молока с установленным значением pH 6,5 ед. объемом 50 мл каждый, предварительно прогретые до температуры 35^oC в ультратермостате, и определяют продолжительность свертывания с момента внесения раствора препарата до момента появления хлопьев параказеина в образующейся пленке молока, периодически наносимого на стенки стаканчика стеклянной палочкой или шпателем.

Количество куриного пепсина в препарате рассчитывают по формуле (1).

Продолжительность свертывания 50 мл молока 1 мл контрольного раствора препарата составила 4,50 мин.

Продолжительность свертывания 50 мл молока 1 мл опытного (термостатированного при 46^oC) раствора препарата составила 15,15 мин.

Содержание куриного пепсина (анализ N 1, табл. 2) в препарате (х) составляет:

Пример 2.

Готовят 2% раствор промышленного препарата, содержащего 30% куриного пепсина и 70% говяжьего пепсина (образец N 2).

Состав буфера, проведение анализа, установление продолжительности свертывания молока, расчет количества куриного пепсина в препарате аналогичны примеру 1.

Результаты анализа приведены в таблице 2.

Пример 3.

Готовят 2% раствор лабораторного образца смешанного препарата, содержащего в своем составе 30% куриного пепсина и 70% говяжьего пепсина.

Состав буфера, проведение анализа, установление продолжительности свертывания молока, расчет количества куриного пепсина в препарате аналогичны примеру 1.

Результаты анализа приведены в таблице 2.

Пример 4.

Готовят 2% раствор лабораторного образца смешанного препарата, содержащего в своем составе 50% куриного пепсина и 50% говяжьего пепсина.

Состав буфера, проведение анализа, установление продолжительности свертывания молока, расчет количества куриного пепсина в препарате аналогичны примеру 1.

Результаты анализа представлены в таблице 2.

Из сопоставления результатов определения количества куриного пепсина в промышленных партиях молокосвертывающих ферментов и лабораторных образцах смешанных препаратов, приготовленных с использованием куриного и говяжьего пепсинов интенсивных технологий, приведенных в табл. 1 и 2, видно, что предлагаемый способ повышает точность определения и воспроизводимость результатов анализа, является менее трудоемким, исключает необходимость использования эталона куриного пепсина в качестве контрольного препарата.

Использование: молочная промышленность. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве контроля исходного буферного раствора исследуемого препарата, ингибирование говяжьего пепсина ведут выдержкой его в растворе 0,2 моль/л натрийкалийфосфатного буфера pH 7,6 ед. В отличие от известного способа подобраны и оптимизированы физико-химические условия проведения анализа, позволяющие определять количество куриного пепсина в смешанных препаратах с говяжьим пепсином "НТ" интенсивной технологии. Способ не требует использования эталона куриного пепсина при проведении анализа. 2 табл.

Способ определения количества куриного пепсина в молокосвертывающих препаратах, предусматривающий ингибирование говяжьего пепсина в буферном растворе, внесение раствора препарата в молоко и установление продолжительности свертывания молока с последующим определением содержания куриного пепсина расчетным путем с использованием контроля, отличающийся тем, что в качестве контроля используют исходный буферный раствор исследуемого препарата, а ингибирование говяжьего пепсина в препарате осуществляют путем выдержки 2% -ного раствора исследуемого препарата в течение 5 мин при температуре 46^oС в 0,2 моль/л натрий-калийфосфатном буфере рН 7,6, при этом количество куриного пепсина в препарате определяют по формуле

где Х количество куриного пепсина в исследуемом препарате,
Т₁ продолжительность свертывания 50 мл молока (субстрата) с установленным значением рН 6,3 1 мл контрольного (исходного) буферного раствора препарата, мин;
T₂ продолжительность свертывания 50 мл такого же молока (субстрата) 1 мл термостатированного буферного раствора препарата в течение 5 мин при 46^oС, мин.