СПОСОБ СОЗДАНИЯ САМОФЕРТИЛЬНЫХ АЛЛОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ЗАМЕЩЕННЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ Российский патент 1997 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к гибридизации и биотехнологии растений и может быть использовано в селекции и генетике сельскохозяйственных растений.

В настоящее время интенсивное развитие получили работы по разработке способов для получения отдаленных гибридов на основе скрещивания ячменя со злаками других родов, в том числе и с мягкой пшеницей. Создание новых форм растений с реконструированными геномами дает возможность получать исходный материал для селекции, а также оригинальные модели для выявления филогенетических взаимодействий между злаками разных таксономических групп, что важно для установления эволюционных закономерностей в семействе злаковых. Наибольшую ценность в таких исследованиях и в селекции имеют работы по получению самофертильных гибридных растений, о создании которых на основе гибридизации культурного ячменя и мягкой пшеницы в мировой литературе не сообщалось.

Известен способ получения ячменно-пшеничных гибридов при скрещивании культурного ячменя с мягкой пшеницей с использованием метода отдаленной гибридизации и методов биотехнологии (1).

Недостатком известного способа является невозможность получения самофертильных аллоплазматических замещенных линий мягкой пшеницы на основе ячменно-пшеничных гибридов.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу прототипом является способ получения ячменно-пшеничных гибридов, включающий скрещивание культурного ячменя сортов Ketch, Clipper, Carina с мягкой пшеницей сорта Chinese spring и линий сорта Приекульский, культивирование зародышей для получения гибридных проростков, получение растений-регенераторов и опыление последних сортом Chinese spring и линиями сорта Приекульский 481 (2).

Недостатком прототипа является его низкая эффективность, так как к третьему беккроссному поколению образуются полностью стерильные растения, неспособные завязывать семена и от беккроссирования.

Технической задачей изобретения является повышение его эффективности.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующих последовательных стадиях:
культурный ячмень сорта Неполегающий скрещивают с мягкой пшеницей сорта Саратовская 29;
вычленяют молодые гибридные зародыши, трансплантируют их на эндоспермы ячменя и культивируют на агаризованной питательной среде с добавлением 0,25-0,5 мг/л кинетина и 0,5-1,0 мг/л ауксина;
пересаживают гибридные проростки в грунт и выращивают в теплице до формирования боковых побегов, из которых вычленяют молодые соцветия и культивируют на питательной среде до образования в каллусе растений-регенерантов;
растения-регенеранты опыляют сортами пшеницы Мироновская 10 и Ульяновка. Из завязавшихся семян выращивают растения BCI.

Растения комбинации (Неполегающий х Саратовская 29) х Мироновская 10 вновь опыляют Мироновской 10, а растения комбинации (Неполегающий х Саратовская 29) х Ульяновка опыляют Саратовской 29.

Для получения следующего поколения беккроссов растения предыдущего поколения двух комбинаций опыляют или Саратовской 29, или Пиротрикс 28.

Установлено, что начиная с третьего поколения (ВСЗ) образуются аллоплазматические линии мягкой пшеницы, стабильно сохраняющие самофертильность.

В процессе отбора самофертильных растений проводили цитогенетический анализ с целью выделения среди растений линий, имеющих мейоз без нарушений и формирующих пыльцевые зерна с жизнеспособностью на уровне исходных сортов пшеницы.

Кроме того, проведен анализ мейоза у гибридов, полученных в результате скрещивания самофертильных аллоплазматических линий с исходным сортом пшеницы Саратовская 29. По наличию унивалентов и тривалентов у таких гибридов устанавливают наличие замещенных хромосом у аллоплазматических линий.

С целью маркирования хромосом ячменя, интрогрессированных в ядерный геном выделенных линий, проводят изоферментный анализ.

В результате получают новые самофертильные формы растений, сочетающих цитоплазму диплоидного ячменя и реконструированные ядерные геномы гексаплоидной пшеницы, которые сформировались в результате замещения одной пары хромосом пшеницы на хромосомы ячменя. Полученные линии характеризуются повышенными хозяйственно-ценными признаками: низкорослостью и раннеспелостью.

Основным определяющим существенным отличием предлагаемого способа является то, что для скрещивания при получении FI ячменно-пшеничных гибридов в качестве материнской формы используется сорт культурного ячменя Неполегающий, цитоплазматические гены которого не оказывают негативного действия на формирование жизнеспособности гамет у F1-BC4 гибридных растений, а третья и седьмая хромосомы этого сорта ячменя, заместив гомеологичные хромосомы пшеницы, несут гены, действие которых в новой генотипической среде не приводит к супрессии жизнеспособности, а также то, что в качестве реккуррентных родителей использованы сорта пшеницы Мироновская 10, Ульяновка, Саратовская 29, Пиротрикс 28 носители Rf-генов, сочетание которых привело к восстановлению самофертильности у аллоплазматической мягкой пшеницы.

Пример конкретного выполнения
При опылении культурного ячменя сорта Неполегающий пшеницы Саратовская 29 гибридные семена завязались с частотой 1,8% к числу опыленных семян. При использовании метода культуры изолированных зародышей при их трансплантации на эндоспермы культурного ячменя и выращивании на среде Мурасиге и Скуга при добавлении 0,25-,05 мг/л кинетина и 0,5-1,0 мг/л индолилуксусной кислоты было получено три гибридных растения, имеющих числа хромосом, равные 2n=35, и достигшие колошения при пересадке гибридных проростков из культуральной среды в грунт.

Регенеранты гибридов были опылены Мироновской 10. Из завязавшихся зерновок были выращены растения, среди которых выделены 49-хромосомные, завязавшие семена при опылении Мироновской 10. Среди ВС2 растений выделены 42-хромосомные растения, которые завязывали семена при опылении Саратовской 29 и Пиротрикс 28.

В следующем ВС3 поколении вновь отобраны растения, имеющие по 42 хромосом. Среди этих растений выделены растения, способные завязывать семена от самоопыления. Самофертильность у полученных растений проверена в течение семи самоопыленных поколений при выращивании растений в теплице и в поле.

Анализ мейоза не выявил каких-либо нарушений в поведении хромосом у аллоплазматических линий по сравнению с исходными сортами пшеницы. Жизнеспособной оказалась и пыльца у этих линий, что подтвердили результаты анализа по скрещиваемости пыльцы ацетокармином. В среднем частота пыльцы, окрашиваемой ацетокармином, у этих линий составила 90,78+0,10% по сравнению с этим значением у Саратовской 29 97,6+0,51% и Пиротрикс 28 98,4+0,42%
При скрещивании полученных линий с Саратовской 29 получены гибридные растения, у которых изучен мейоз. Выявлено образование от 1 до 6 унивалентов и до 1 тривалента на клетку, что обусловлено присутствием пары негомологических хромосом у аллоплазматических линий.

Биохимический анализ по идентификации изоферментных маркеров подтвердил факт замещения одной пары третьей или пятой гомеологической группы хромосом пшеницы на гомеологичные хромосомы культурного ячменя у полученных самофертильных линий пшеницы.

В таблице приведены показатели фертильности у аллоплазматических замещенных линий мягкой пшеницы, полученных в результате беккроссирования ячменно-пшеничных гибридов культурный ячмень х мягкая пшеница разными сортами пшеницы по сравнению с сортом мягкой пшеницы Саратовская 29 при выращивании растений в гидропонной теплице.

Из таблицы видно, что по показателям фертильности, оцененным по числу семян на колос и на растение, а также по массе 1000 зерен две аллоплазматические замещенные линии пшеницы не отличаются от сорта мягкой пшеницы Саратовская 29.

Аллоплазматическая замещенная линия, выделенная от беккроссов (НхС) х М х М х П, характеризуется ускоренным в среднем на 6 дней развитием от появления всходов до колошения и соответственно созревания по сравнению с сортом Саратовская 29. Высота растений у данной линии составляет в среднем 80% от высоты растений Саратовская 29. Аллоплазматическая замещенная линия, выделенная от беккроссов (НхС) х М х М х С, по сравнению с Саратовской 29 быстрее выколашивается и созревает в среднем на 3 дня быстрее. Высота растений этой линии в среднем не отличается от сорта Саратовская 29.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
у потомков ячменно-пшеничных гибридов восстанавливается самофертильность, которая стабильно сохраняется в течение семи самоопыленных поколений при выращивании растений и в теплице, и в поле;
у полученных линий пшеницы чужеродной является не только цитоплазма, но и по одной паре хромосом ячменя, которые заместили пшеничные хромосомы, что обусловливает усиление хозяйственно-ценных признаков создаваемых линий пшеницы;
полученные новые самофертильные линии мягкой пшеницы являются прекрасным исходным материалом для селекции, так как имеют повышенные хозяйственно-ценные признаки, а также могут быть использованы в качестве моделей для изучения филогенетических взаимодействий между злаками разных таксономических групп.

Использование: селекция и генетика сельскохозяйственных растений. Сущность: при создании самофертильных аллоплазматических замещенных линий пшеницы в качестве исходной материнской формы используют сорт культурного ячменя Неполегающий, а в качестве реккурентных родителей в процессе беккроссирования используют сорта мягкой пшеницы Мироновская 10, Ульяновка, Саратовская 29, Пиротрикс 28. В процессе беккроссирования первое беккросное поколение получают путем скрещивания гибридов (Неполегающий х Саратовская 29 с сортами пшеницы Мироновская 10) или Ульяновка, а второе беккросное поколение получают на основе гибридной комбинации (Неполегающий х Саратовская 29) х Мироновская 10 путем повторного опыления сортом пшеницы мироновская 10, а на основе гибридной комбинации (Неполегающий х Саратовская 29) х Ульяновка путем опыления сортов пшеницы Саратовская 29. При этом последующие самофертильные аллоплазматические замещенные линии мягкой пшеницы получают путем беккросирования предыдущего поколения линий сортами пшеницы Саратовкая 29 или Пиротрикс 28. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ создания самофертильных аллоплазматических замещенных линий пшеницы, включающий скрещивание культурного ячменя с мягкой пшеницей, культивирование гибридных зародышей для получения гибридных проростков, получение растений-регенерантов и беккроссирование последних с различными генотипами мягкой пшеницы, отличающийся тем, что в качестве исходной материнской формы используют сорт культурного ячменя "Неполегающий", а в качестве реккурентных родителей в процессе беккроссирования используют сорта мягкой пшеницы "Мироновская 10", "Ульяновка", "Саратовская 29", "Пиротрикс 28". 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе беккроссирования первое беккроссное поколение получают путем скрещивания гибридов ("Неполегающий" х "Саратовская 29") с сортами пшеницы "Мироновская 10" или "Ульяновка", а второе беккроссное поколение получают на основе гибридной комбинации ("Неполегающий" х "Саратовская 29") х "Мироновская 10" путем повторного опыления сортом пшеницы "Мироновская 10", а на основе гибридной комбинации ("Неполегающий" х "Саратовская 29") х "Ульяновка" путем опыления сортом пшеницы "Саратовская 29". 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что последующие самофертильные аллоплазматические замещенные линии мягкой пшеницы получают путем беккроссирования предыдущего поколения линий сортами пшеницы "Саратовская 29" или "Пиротрикс 28".