СПОСОБ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С УДЛИНЕННЫМ СРОКОМ КОЛОШЕНИЯ И С КОМПЛЕКСНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ Российский патент 2014 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в генетике и селекции зерновых культур.

Одним из важных хозяйственных признаков пшеницы являются сроки колошения, согласно которым выделяют раннеспелые, среднеранние, среднеспелые, среднепоздние и позднеспелые сорта. Сроки колошения у 80% российских сортов яровой мягкой пшеницы контролируются генами Vrn-A1 и Vrn-B1, при этом замена одного из этих генов на ген, происходящий из генома сородичей мягкой пшеницы, приводит к удлинению срока колошения на 3-7 дней. Правильный подбор времени колошения в каждой агроклиматической зоне позволяет уменьшить неблагоприятное влияние абиотических (засуха, холод) и биотических факторов (грибные патогены) и способствует увеличению объемов сельскохозяйственной продукции.

В связи с меняющимися климатическими условиями оптимальным является выращивание мозаики сортов, различающихся по времени колошения, что приводит к минимизации потерь в случае неблагоприятных погодных условий или эпифитотий [1].

В настоящее время в регионах, производящих яровые сорта пшеницы, наиболее распространены и вредоносны болезни, вызываемые грибными патогенами: бурая и стеблевая ржавчина и мучнистая роса. Современная стратегия селекции пшеницы направлена на создание сортов, обладающих комплексной устойчивостью к нескольким грибным заболеваниям [2]. Трудности традиционной селекции как на устойчивость к болезням, так и на сроки колошения связаны с длительным процессом ее проведения. Использование молекулярных маркеров позволяет сократить время и снизить затраты по созданию форм, отличающихся сроками колошения и устойчивостью к грибным болезням.

Известен способ отбора скороспелых форм пшеницы [3], заключающийся в том, что у гибридных растений, выращиваемых в условиях короткого светового дня (12 часов), на стадии выхода колоса из трубки проводят измерения у полностью сформировавшихся листьев 4-6 ярусов 10-15-дневного возраста величины оптического коэффициента поглощения падающего монохроматического излучения в диапазоне длин волн 730-740 нм и последующей дифференциации растений при длине волны 730 нм с более высоким коэффициентом поглощения на скороспелые формы и с более низким коэффициентом - как более позднеспелые формы. Однако данный способ является трудоемким, ввиду необходимости регулярного проведения фенотипической оценки индивидуальных растений и необходимости регуляции продолжительности светового дня.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине [4], заключающийся в том, что линию-донор, содержащую в геноме не более шести фрагментов хромосом T. timopheevii, для которой предварительно проведен молекулярно-генетический анализ, установлена хромосомная локализация генов устойчивости и определены ДНК-маркеры для генов устойчивости, скрещивают с коммерческим сортом мягкой пшеницы, далее гибриды первого поколения (F₁) беккроссируют двукратно на исходный сорт, потомство BC₂F₁ тестируют ДНК-маркерами cfe229 и cfe204 к гену устойчивости Lr и отбирают линии, несущие ДНК-маркеры; отобранные линии беккроссируют третий раз, проводят самоопыление потомства и в потомстве BC₃F₁ отбирают линии, несущие ДНК-маркеры к гену устойчивости Lr в гомозиготном состоянии. На заключительном этапе потомство BC₃F₂ тестируют в полевых условиях.

Недостатками данного способа являются:

1. Трудоемкость способа ввиду необходимости проведения нескольких этапов беккроссирования исходной линии-донора коммерческим сортом мягкой пшеницы.

2. Необходимость проведения предварительного молекулярного анализа линии-донора для выявления числа фрагментов интрогрессии Т.timopheevii и установления хромосомной локализации Lr гена устойчивости к бурой ржавчине.

3. Ограниченные функциональные возможности способа, поскольку он позволяет получать линии, устойчивые только к одному грибному заболеванию - бурой ржавчине.

4. Необходимость тестирования большой гибридной популяции для выявления растений, отличающихся временем колошения.

Задачей предлагаемого изобретения является создание линий яровой мягкой пшеницы с удлиненным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням.

Технический результат заключается в упрощении известного способа и расширении его функциональных возможностей.

Поставленная задача решается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Гибридную линию яровой мягкой пшеницы (линия-донор), содержащую фрагмент хромосомы с двумя генами от Aegilops speltoides: ген VRN-Asp1, определяющий удлинение срока колошения, и ген LrAsp5 устойчивости к бурой ржавчине, скрещивают с линией, содержащей ген устойчивости Pm к мучнистой росе из генома ржи Secale cereale, и растения поколения F₁ самоопыляют до поколения F₂. Из поколения F₂ с помощью молекулярного ПЦР-маркера Pr1/Pr5 отбирают растения, содержащие гены VRN-Asp1 и LrAsp5 в гомозиготном состоянии. Отобранные с помощью ПЦР-маркера Pr1/Pr5 растения F₂ с генами VRN-Asp1 и LrAsp5 проверяют молекулярным маркером SCM009 для выявления растений с геном Pm устойчивости к мучнистой росе.

Основными определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:

- в качестве линии-донора используют гибридную линию мягкой пшеницы, содержащую ген VRN-Asp1, определяющий удлинение срока колошения и ген устойчивости к бурой ржавчине LrAsp5;

- из поколения F₂ с помощью молекулярного ПЦР-маркера Pr1/Pr5 отбирают растения, содержащие два гена - ген VRN-Asp1, определяющий удлинение срока колошения, и ген устойчивости к бурой ржавчине LrAsp5, что позволяет на ранних стадиях создания линий мягкой пшеницы быстро и экономично отбирать устойчивые к бурой ржавчине растения с удлиненным сроком колошения без проведения полевых испытаний;

- растения F₂, отобранные с помощью ПЦР маркера Pr1/Pr5, анализируют с помощью ПЦР-маркера SCM009 для отбора растений, содержащих ген Pm устойчивости к мучнистой росе, что позволяет получить растения с комплексной устойчивостью к грибным болезням.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Гибридные линии яровой мягкой пшеницы с генетическим материалом Aegilops speltoides, устойчивые к бурой ржавчине, были оценены в полевых условиях на сроки колошения. Среди проверенных образцов была отобрана линия яровой мягкой пшеницы, содержащая ген VRN-Asp1, определяющий удлинение срока колошения и ген устойчивости к бурой ржавчине LrAsp5 (линия-донор 21-12), проявляющая высокий уровень устойчивости к бурой ржавчине (по шкале иммунности Майнса и Джексона [5]) и более длинный период колошения. В таблице 1 представлены данные (в баллах) по устойчивости гибридных линий к бурой ржавчине и данные (в днях) по времени колошения. Из таблицы 1 видно, что линия 832-2 (прототип), содержащая ген Lr устойчивости к бурой ржавчине от Т.timopheevii (прототип), показала высокий уровень устойчивости (балл 0 и 1 по шкале иммунности) к этой же популяции бурой ржавчины, но при этом имела более короткое время колошения.

Цитологический и молекулярный анализ показал, что линия-донор имеет фрагмент генома Aegilops speltoides, содержащий два гена - ген устойчивости к бурой ржавчине (LrAsp5) и ген, определяющий более длинный срок колошения (VRN-Asp1) [6].

Линию-донор скрещивали с линией, содержащей ген устойчивости к мучнистой росе (Pm) из генома ржи Secale cereale (линия-реципиент 29-2). Полученные от скрещивания гибридные растения поколения F₁ самоопыляли до поколения F₂ и в поколении F₂ с помощью ПЦР-маркера Pr1/Pr5 отбирали растения, содержащие два гена VRN-Asp1 и LrAsp5, в гомозиготном состоянии. Нуклеотидная последовательность ПЦР-маркера Pr1/Pr5, условия реакции ПЦР и размер фрагмента амплификации приведены в таблице 2.

Результаты анализа для ПЦР-маркера Pr1/Pr5 с геномной ДНК линии-донора (21-12), линии-реципиента (29-2) и растений поколения F₂, полученных от скрещивания линии-донора и линии-реципиента (29-2), содержащих (растения 1, 3 и 4) и не содержащих (растения 2 и 5) гены VRN-Asp1 и LrAsp5, приведены на фиг. 1. Фрагмент ДНК длиной 1100 п.н., свидетельствующий о наличии генов VRN-Asp1 и LrAsp5, указан стрелкой.

Отобранные с помощью ПЦР-маркера Pr1/Pr5 растения поколения F₂, содержащие гены VRN-Asp1 и LrAsp5 в гомозиготном состоянии, проверяли с помощью ПЦР-маркера SCM009 для выявления растений, содержащих ген Pm устойчивости к мучнистой росе. На фиг. 2 представлены результаты анализа ПЦР-маркером SCM009 линии-донора (21-12), линии-реципиента (29-2) с геном Pm и растений популяции F₂, содержащих (растения 1 и 3) и не содержащих (растения 2, 4, 5) ген Pm. Фрагмент ДНК длиной 250 п.н., свидетельствующий о наличии гена Pm устойчивости к мучнистой росе, указан стрелкой.

Растения поколения F₂, отобранные с помощью ПЦР-маркеров Pr1/Pr5 и SCM003, самоопыляли до поколения F₃ и в полевых условиях проводили оценку сроков колошения и устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе (по шкале иммунности Прескотта и Сари [7]). Результаты представлены в таблице 3.

Полученные результаты показали эффективность применения ПЦР-маркеров Pr1/Pr5 и SCM009 для создания линий яровой мягкой пшеницы с комплексной устойчивостью к грибным болезням и более длинным сроком колошения.

Таким образом, созданные предложенным способом линии яровой мягкой пшеницы могут пополнить генофонд мягкой пшеницы по генам устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе и могут быть использованы в селекционных программах как доноры генов для получения сортов яровой мягкой пшеницы с удлиненными сроками колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням. Молекулярные ПЦР-маркеры Pr1/Pr5 и SCM009 позволят отбирать линии с увеличенным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням без проведения полевых тестов и, соответственно, сократить срок создания новых форм мягкой пшеницы.

Источники информации

1. Романенко А.А., Беспалова Л.А., Кудряшов И.Н., Аблова И.Б. 2005. Новая сортовая политика и сортовая агротехника озимой пшеницы. Издательство «ЭДВИ», Краснодар, Россия. 221 стр.

2. Маркелова Т.С. Основные направления селекции пшеницы на устойчивость к болезням. Защита и карантин растений 2011, №1: 21-23.

3. Способ отбора скороспелых форм пшеницы. Патент Российской Федерации №2300193, опубл. 10.06.2007.

4. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине. Патент Российской Федерации №2407283, опубл. 27.12.2010.

5. Mains E.B., Jackson H.S. Physiological specialization in the leaf rust of wheat, Puccinia triticina Erikss. Phytopathology 1926, 16: 89-120.

6. Адонина И.Г., Сусолкина (Петраш) Н.В., Тимонова Е.М., Христов Ю.А., Салина Е.А. Создание и изучение устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы с транслокациями от Aegilops speltoides Tausch. Генетика, 2012, 48: 488-494.

7. Захаренко В.А., Медведев A.M., Ерохина С.А. и др. Методика по оценке устойчивости сортов полевых культур на инфекционных и провокационных фонах. М.: Россельхозакадемия, 2000. 88 с.

Таблица 1 № гибридной линии Устойчивость к бурой ржавчине (в баллах) Время колошения (дни) 6-3 4 52 7-2 3 52 7-6 4 52 11-2 4 60 11-6 3 56 13-3 2 52 17-7 2 56 17-12 2 60 21-8 0 52 21-12 0-1 60 Линия 832-2 0-1 52

Таблица 2 Маркер Pr1/Pr5 Нуклеотидные последовательности 5'-TACCCCTGCTACCAGTGCGC-3' праймеров 5'-GGCCAACCCTACACCCCAAG-3' Условия реакции ПЦР (1 мин при 94°C, 1 мин при 55°C, 1 мин при 72°C): 30 циклов Размер продукта амплификации 980 и 1100 пар нуклеотидов Условия проведения электрофореза 1% агароза

Таблица 3 Образец Устойчивость к бурой ржавчине (в баллах) Устойчивость к мучнистой росе (в баллах) Время колошения (дни) Наличие ПЦР-маркера Pr1/Pr5 Наличие ПЦР-маркера SCM009 Линия 21-12 0-1 3 60 присутствует отсутствует Линия 29-2 4 9 54 отсутствует присутствует Растение 1 0-1 9 60 присутствует присутствует Растение 2 4 3 54 отсутствует отсутствует Растение 3 0-1 9 60 присутствует присутствует Растение 4 0-1 3 60 присутствует отсутствует Растение 5 4 3 54 отсутствует отсутствует

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии. Гибридную линию яровой мягкой пшеницы, содержащую фрагмент хромосомы с двумя генами от Aegilops speltoides: ген, определяющий удлинение срока колошения (VRN-Asp1), и ген устойчивости к бурой ржавчине (LrAsp5), скрещивают с линией, содержащей ген устойчивости к мучнистой росе (Pm) из генома ржи Secale cereale, и растения поколения F₁ самоопыляют до поколения F₂. Из поколения F₂ с помощью молекулярного ПЦР-маркера Pr1/Pr5 отбирают растения, содержащие гены VRN-Asp1 и LrAsp5 в гомозиготном состоянии. Отобранные с помощью ПЦР-маркера Pr1/Pr5 растения F₂ с генами VRN-Asp1 и LrAsp5 проверяют ПЦР-маркером SCM009 для выявления растений с геном Pm устойчивости к мучнистой росе. Использование заявленного способа позволяет упростить известный способ и создать линии яровой мягкой пщеницы с удлиненным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням. 2 ил., 3 табл.

Способ создания линий яровой мягкой пшеницы с удлиненным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням, включающий скрещивание исходных линий яровой мягкой пшеницы, самоопыление гибридов первого поколения F₁ для получения гибридов второго поколения F₂, среди которых с помощью молекулярных ПЦР-маркеров отбирают растения с геном устойчивости к бурой ржавчине, повторное самоопыление отобранных растений для получения поколения F₃ и тестирование последних в полевых условиях на устойчивость к бурой ржавчине, отличающийся тем, что гибридную линию яровой мягкой пшеницы, содержащую ген устойчивости к бурой ржавчине (LrAsp5) и ген, определяющий удлинение времени колошения (VRN-Asp1), скрещивают с линией яровой мягкой пшеницы, содержащей ген устойчивости к мучнистой росе (Pm) из генома ржи Secale cereale, и среди гибридов поколения F₂ проводят отбор растений, содержащих гены LrAsp5, VRN-Asp1 и Pm с помощью последовательного применения ПЦР-маркеров Pr1/Pr5 и SCM009.