СПОСОБ СОЗДАНИЯ САМОФЕРТИЛЬНЫХ АЛЛОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ЭУПЛОИДНЫХ И АНЕУПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ Российский патент 1999 года по МПК A01H1/04 A01H1/02 

Изобретение относится к гибридизации и биотехнологии растений и может быть использовано в селекции и генетике сельскохозяйственных растений.

В настоящее время актуальным является направление работ по разработке способов получения новых форм растений на основе отдаленных скрещиваний дикорастущих видов ячменя с культивируемыми злаками, в том числе и с мягкой пшеницей. Новые формы растений, созданные на основе реконструкции геномов при отдаленной гибридизации, представляют интерес в качестве исходного материала для селекции и как уникальные модели для изучения взаимодействия чужеродных геномов и особенностей преобразования геномов при видообразовании. Наиболее ценными в таких исследованиях являются растения с восстановленной самофертильностью и сочетающие геномы представителей разных таксономических групп, о создании которых на основе гибридизации дикорастущего ячменя H.geniculatum All. (= H.narinum subsp. gussoneanum) (2n=28) и мягкой пшеницы в мировой литературе не сообщалось.

Известен способ получения ячменно-пшеничных гибридов при скрещивании дикорастущего ячменя H.marinum с мягкой пшеницей с использованием метода отдаленной гибридизации и метода культуры изолированных зародышей (Jiming Jiang, Dajun Liu. New Hordrum-Triticum hybrids // Cereal Research Communication. 1987. V.15. N 2-3. P.95-99).

Недостатком известного способа является получение только самостерильных гибридов первого поколения с незначительно выраженной женской фертильностью.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения ячменно-пшеничных гибридов, включающий скрещивание дикорастущего ячменя H.genicalatum All. с мягкой пшеницей Chinese Spring, культивирование зародышей для получения гибридных проростков и опыление их пшеницей сорта Chinese Spring (Clauss E. Bastarde aus Hordeum geniculatum All. und Triticum aestivum L. // Arch.Zuchtungsforsch., Berlin. 1983. V.13. N 6. S.413-418).

Недостатком прототипа является его низкая эффективность, так как способ ограничивается только получением самостерильных гибридов первого поколения, для которых была характерна только частичная женская фертильность.

Технической задачей изобретения является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующих последовательных стадиях:
дикорастущий ячмень Н. geniculatum All. скрещивают с мягкой пшеницей сорта Пиротрикс 28;
опыленные цветки обрабатывают раствором гиббереллина;
вычленяют молодые гибридные зародыши и культивируют на питательной среде;
гибридные проростки пересаживают в грунт и выращивают в теплице до колошения и образования боковых побегов, из которых вычленяют молодые колосья и культивируют на питательной среде до образования в каллусе растений-регенерантов;
часть растений-регенерантов обрабатывают раствором колхицина и высаживают в грунт, собирая затем завязавшиеся от самоопыления зерновки;
растения, выращенные из этих зерновок, и растения-регенеранты, не обработанные колхицином, опыляют пшеницей сорта Пиротрикс 28.

Второе и третье беккроссные поколения преимущественно получают следующим образом:
часть растений комбинаций (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 и все растения {(H.geniculatum х Пиротрикс 28) + колхицин] х Пиротрикс 28 оставляют на самоопыление, а другую часть растений (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 опыляют пшеницей сортов Пиротрикс 28, Новосибирская 67;
часть растений комбинаций (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 х Новосибирская 67 оставляют на самоопыление, а часть опыляют сортом пшеницы Новосибирская 67.

Из всех завязавшихся от самоопыления зерновок у растений комбинаций (H. geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28, {(H.geniculatum х Пиротрикс 28) + колхицин] х Пиротрикс 28, (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 х Пиротрикс 28, (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 х Новосибирская 67 и (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 х Новосибирская 67 х Новосибирская 67 выращивают растения и формируют отдельные самофертильные линии.

При отборе самофертильных линий проводят цитогенетический анализ с целью выявления эуплоидных и анеуплоидных аллоплазматических линий, изучения особенностей мейоза и формирования пыльцевых зерен с жизнеспособностью на уровне исходных сортов пшеницы и контроля за сохранением числа хромосом в соматических клетках каждой линии.

В результате получают новые аллоплазматические самофертильные линии растений, имеющие цитоплазму дикорастущего ячменя H.geniculatum и эуплоидное число хромосом, характерное для мягкой пшеницы (2n=42), или анеуплоидное число хромосом (2n= 43, 2n=40+2t, 2n=42+t; 2n=44). Полученные линии характеризуются хозяйственно ценным признаком: повышенным содержанием белка в зерновках.

Основными определяющими существенными отличиями предлагаемого способа являются:
- в качестве отцовской формы при опылении дикорастущего ячменя H.geniculatum используют сорт мягкой пшеницы Пиротрикс 28, что позволяет получать жизнеспособные растения ячменно-пшеничного гибрида;
- растения- регенеранты получают путем культивирования молодых соцветий исходных гибридов, что дает возможность значительно увеличить число исходных гибридных растений;
- обработка части растений регенерантов раствором колхицина позволяет получить амфиплоиды с частично восстановленной фертильностью;
- введение в беккроссирование с гибридами сортов мягкой пшеницы Пиротрикс 28 и Новосибирская 67 позволяет восстановить самофертильность у потомков беккроссных поколений и получить генотипическое многообразие аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий с повышенным содержанием белка по сравнению с исходными сортами пшеницы.

Пример конкретного выполнения.

При опылении дикорастущего ячменя H.geniculatum All. сортом пшеницы Пиротрикс 28 и последующей обработке опыленных цветков гибберелловой кислотой завязались гибридные зерновки. Из незрелых гибридных зерновок были вычленены зародыши, которые культивировали на искусственной питательной среде. Из боковых побегов 35-хромосомных гибридов были вычленены молодые соцветия, которые при культивировании на питательной среде формировали каллус с регенерацией проростков. Перед пересадкой в грунт часть регенерантов обрабатывали раствором колхицина. У этих растений, имеющих в соматических клетках по 68-70 хромосом, в результате самоопыления завязывались зерновки, из которых были выращены 48-55-хромосомные растения. Эти растения и регенеранты, не обработанные колхицином, опыляли пшеницей сорта Пиротрикс 28.

Проводили отбор BC₁, растений комбинаций (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 и [(H.geniculatum х Пиротрикс 28) + колхицин] х Пиротрикс 28 по числу хромосом и способности завязывать зерновки от самоопыления. Из этих зерновок были выращены растения с числом хромосом 2n=46, 2n=48, 2n=50, 2n= 55. Из зерновок, завязавшихся при самоопылении этих растений, были выращены растения, каждое из которых стало родоначальником отдельных линий, среди которых самофертильными были 42-, 43- и 44-хромосомные.

Часть растений BC₁ комбинации (H.geniculatum х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 опыляли сортами пшеницы Пиротрикс 28 и Новосибирская 67. Из завязавшихся от самоопыления зерновок у растений BC₂ комбинации (H.geniculatum All. х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 х Пиротрикс 28 выращены растения с числом хромосом 2n= 42, 2n=44, 2n=46, которые завязывали зерновки от самоопыления и дали начало новым 42-, 43-хромосомным линиям.

Среди растений, выращенных из зерновок, завязавшихся от самоопыления у растений (H.geniculatum All. х Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 х Новосибирская 67, были выделены растения с числом хромосом 2п=42 или 2n=42+t, которые завязывали зерновки от самоопыления. В следующих самоопыленных поколениях от этих растений получали линии, в которых контролировали число хромосом в соматических клетках, продолжая поддерживать линии с соответствующим числом хромосом.

Часть растений (H.geniculatum All. х Пиротрикс 28) x Пиротрикс 28 х Новосибирская 67 вновь опыляли сортом пшеницы Новосибирская 67. Из зерновок, завязавшихся в результате такого опыления, были выделены растения с числом хромосом 2n=40+2t. Из зерновок, завязавшихся у этих растений при самоопылении, выращены растения, среди которых вновь отбирали растения с числом хромосом 2n=40+2t.

В таблице приведены значения фертильности при самоопылении у некоторых из созданных линий, оцененные по числу зерновок, завязавшихся в среднем на один колос и одно растение, а также масса 1000 зерен.

Из таблицы видно, что все эуплоидные (2n=42) и анеуплоидные линии пшеницы (2n= 43, 2n=44, 2n=42+t, 2n=40+2t) завязывают зерновки при самоопылении. Причем у всех линий зерновки пшеничного типа и достоверно крупнее, чем у дикорастущего ячменя, что видно из данных сравнения массы 1000 зерен.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
у беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов восстанавливается самофертильность, которая стабильно сохраняется в последующих самоопыленных поколениях как у эуплоидных, так и анеуплоидных линий;
полученным линиям, имеющим цитоплазму дикорастущего ячменя и измененный относительно родительских сортов мягкой пшеницы ядерный геном, передан от дикорастущего ячменя важный хозяйственный признак - повышенное в среднем на 5% содержание белка в зерновках по сравнению с родительским сортом мягкой пшеницы;
полученные новые самофертильные линии мягкой пшеницы являются ценным исходным материалом для селекции, так как имеют повышенный хозяйственно-ценный признак, а также могут быть использованы в качестве моделей для изучения взаимодействия геномов ячменя и пшеницы и филогенетического родства между злаками разных таксономических групп.

Способ может быть использован в селекции и генетике растений. При создании самофертильных аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий пшеницы получают гибриды, используя в качестве исходной материнской формы дикорастущий ячмень H.geniculatum All(=H.marinum subspgussoneanum), в качестве отцовской формы и первого реккурентного родителя - сорт мягкой пшеницы Пиротрикс 28. Первое беккроссное поколение получают путем скрещивания гибридов с сортом пшеницы Пиротрикс 28, второе беккроссное поколение получают на основе самофертильной гибридной комбинации (H.geniculatum All. • Пиротрикс 28) • Пиротрикс 28 путем повторного опыления сортами пшеницы Пиротрикс 28 или Новосибирская 67. Третье беккроссное поколение получают при повторном опылении растений комбинации (H.geniculatum All. • Пиротрикс 28) • Пиротрикс 28 • Новосибирская 67 сортом пшеницы Новосибирская 67. Использование последовательности беккроссов и обработка растений-регенерантов колхицином обеспечивает восстановление самофертильности у потомков беккроссных поколений и ее стабильное сохранение в последующих самоопыленных поколениях, а также повышение содержания белка в зерновых по сравнению с родительскими сортами пшеницы. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ создания самофертильных аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий мягкой пшеницы, включающий скрещивание дикорастущего ячменя H. geniculatum All. с мягкой пшеницей, культивирование гибридных зародышей для получения гибридных растений, беккроссирование последних мягкой пшеницей, отличающийся тем, что в качестве отцовской формы при опылении дикорастущего ячменя используют сорт мягкой пшеницы Пиротрикс 28, а растения-регенеранты получают путем культивирования молодых соцветий гибридных растений, часть из которых перед беккроссированием обрабатывают раствором колхицина, а в качестве рекуррентных родителей при беккроссировании используют сорта мягкой пшеницы Пиротрикс 28, Новосибирская 67. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что часть растений первого беккроссного поколения комбинации (H.geniculatum All. x Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 и все растения [(H.geniculatum All. x Пиротрикс 28) + колхицин] х Пиротрикс 28 оставляют на самоопыление, а часть растений (H.geniculatum All. x Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 опыляют сортами пшеницы Пиротрикс 28 и Новосибирская 67. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что последующие самофертильные аллоплазматические линии мягкой пшеницы получают путем беккроссирования растений предыдущего поколения (H.geniculatum All. x Пиротрикс 28) х Пиротрикс 28 х Новосибирская 67 сортом пшеницы Новосибирская 67.