СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биофизике, а более конкретно к оптическим биосенсорам.

В настоящее время все живые микроорганизмы в жидкости регистрируются наблюдением посредством оптического микроскопа методами биолюминенсенции селективного окрашивания. Общим недостатком этих методов является низкая степень автоматизации измерений.

Наиболее близким к предлагаемому способу является оптический способ обнаружения подвижных микроорганизмов (прототип) путем измерения коэффициентов диффузии рассеивающих центров. В этом способе лазерное излучение проходит через исследуемую жидкость, рассеивается находящимися в жидкости частицами (броуновское движение) и подвижными микроорганизмами. Рассеянное излучение, интерферируя в плоскости наблюдения, формирует динамическую спектр-картину, фурье-спектр флуктуаций интенсивности которой регистрируется. По полуширине этого спектра вычисляют коэффициент-диффузии и по его величине определяют наличие подвижных микроорганизмов.

Однако для того, чтобы отличить ПМ от БЧ, необходимо иметь априорную информацию о размерах исследуемых частиц, что снижает применимость метода. Например, при низкой подвижности ПМ или при БЧ малого размера различить спектры не удается. Кроме того, требуется измерение фурье-спектра с высокой точностью, что затрудняет и удорожает создание приборов, работающих в реальном времени.

Предлагаемый способ позволяет преодолеть указанные недостатки путем измерения средней интенсивности флуктуаций спекл-картины в ограниченном снизу частотном диапазоне, связанной как с концентрацией броуновских частиц (БЧ), так и с подвижностью микроорганизмов (ПМ). Одновременно известным способом измеряется мутность исследуемой среды, связанная только с концентрацией БЧ и ПМ, но не зависящая от подвижности ПМ. Это позволяет различить в выходном сигнале вклады от концентрации БЧ и ПМ от вклада, связанного с подвижностью микроорганизмов. Ограничение частотного диапазона снизу позволяет уменьшить вклад в выходном сигнале от концентрации БЧ, чей спектр лежит в низкочастотной области и мало изменяет сигнал, связанный с подвижностью микроорганизмов, лежащий в более высокочастотной области. Это позволяет повысить чувствительность способа при обнаружении малых сигналов от ПМ на фоне большого сигнала от БЧ. Предлагаемый способ проще, поскольку не требуется информации о размерах частиц и измерения фурье-спектра.

На фиг. 1 представлены типичные амплитудно-частотные спектры выходных сигналов, где 1-фуpье-спектp БЧ, 2-фурье-спектр ПМ; на фиг. 2 интегральные величины, измеряемые в предлагаемом способе, где 3 амплитудно-частотная характеристика ограничения спектра снизу, область 4 интегральный сигнал U_вых1 для БЧ, область 5 интегральный сигнал U_вых для БЧ + ПМ; на фиг.3 зависимость сигнала U_вых1 от мутности жидкости Т (сплошная линия), где ΔU вклад в выходной сигнал, обусловленный подвижностью микроорганизмов.

Способ реализуется следующим образом.

Лазерное излучение, проходя через исследуемую жидкость, рассеивается частицами в жидкости и, интерферируя в плоскости фотоприемника, образует динамическую спекл-картину. Амплитудно-частотный спектр флуктуаций фототока представляет лоренцевскую линию

где U напряжение на фотоприемнике;
U₀ множитель, имеющий размерность напряжения;
Δω полушиpина лоренцевской линии;
w текущая частота;
Δω ~ D•sin²Φ где v угол наблюдения;
D -коэффициент диффузии рассеивающих частиц, для БЧ D обратно пропорционален их радиусу r:

а для ПМ D пропорционально корню из их скорости v

Для ПМ D больше, чем для БЧ, что позволяет обнаружить подвижные микроорганизмы в жидкости. На фиг. 1 представлены лоренцевские спектры (1) для БЧ и ПМ 2 с большой подвижностью в предположении их одинаковой концентрации и размеров. При этом площади под соответствующими кривыми одинаковы, а U _→ ∞ при ω = 0 и Δω _→ 0 При наличии в исследуемой среде одновременно БЧ и ПМ результирующий спектр является суперпозицией спектров, приведенных на фиг. 1. При ограничении снизу частотного спектра измеряемого сигнала U_вых регистрируемая интенсивность для БЧ уменьшается значительно сильней, чем для ПМ (области 4 и 5 соответственно на фиг.2), поскольку большая часть БЧ -спектра расположена в низкочастотной области. Нижняя граничная частота выбиралась вблизи типичного для БЧ, размером около микрона и составляла 1-10 Гц. Конкретное ее значение не является критичным параметром. При этом U_вых1 БЧ -спектра определяется независимо путем измерения мутности среды. Это поясняется на фиг. 3, на которой представлена экспериментальная зависимость U_вых1(Т) средней амплитуды флуктуаций спекл-картины от мутности среды Т при наличии в ней только БЧ (сплошная линия). Мутность Т измерялась фотоприемником по интегральной интенсивности рассеянного света и также имела размерность напряжения. Тогда при наличии в среде только БЧ
U_вых1=К•Т (4)
где К коэффициент пропорциональности, постоянный для данной реализации способа. В реальной среде с наличием как БЧ так и ПМ в измеряемом сигнале U удается различить вклад ПМ как превышение U над (4)
U_вых = U_вых1 + ΔU (5)
Наличие ΔU и ее величина характеризует наличие ПМ и их активность в исследуемой среде (см. фиг.3). Относительный вклад сигнала от ПМ можно характеризовать также отношением ΔU/U_вых.
Чувствительность предлагаемого способа выше по сравнению с прототипом, поскольку возможно выделить "чистый" вклад от ПМ в регистрируемом сигнале; в прототипе же регистрируется только суммарный спектр от БЧ и ПМ. В наших экспериментах чувствительность ΔU/U_вых составила около 10%
С целью обнаружения динамических процессов, связанных как с подвижными, так и не самодвижущимися, но живыми микроорганизмами (например, процессы деления), измерялись первые и более высокие производные dU_вых/dt, характеризующие например, скорость изменения концентраций живых микроорганизмов.

Таким образом, предлагаемый способ работоспособен и промышленно применим.

Изобретение относится к оптическим биосенсорам и позволяет с высокой чувствительностью обнаруживать наличие подвижных микроорганизмов /ПМ/ в жидкости даже в присутствии большого количества броуновских частиц. Сущность изобретения: измеряют среднюю амплитуду флуктуаций интенсивности рассеянного на частицах в жидкости лазерного излучения, которая пропорциональна как концентрации, так и подвижности частиц. Измеряют мутность жидкости, которая пропорциональна только концентрации частиц, и по сравнению обоих сигналов определяют наличие ПМ в жидкости. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ обнаружения живых микроорганизмов, включающий пропускание лазерного излучения через анализируемую пробу, измерение параметра, характеризующего амплитудно-частотный спектр флуктуации рассеянного лазерного излучения в пробе, отличающийся тем, что дополнительно измеряют параметр, характеризующий мутность пробы, а параметр, характеризующий амплитудно-частотный спектр флуктуации рассеянного лазерного излучения, измеряют при ограничении нижнего предела диапазона частот, а о наличии живых микроорганизмов судят, сравнивая измеренные параметры. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нижний предел диапазона частот устанавливают с учетом полуширины линии Лоренца. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно вычисляют производные измеренных параметров.