СПОСОБ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА МИКРООБЪЕКТ МАГНИТНЫМ ПОЛЕМ Российский патент 1997 года по МПК A61N2/04 

Изобретение относится к области биологии, медицины, ветеринарии. Более точно оно относится к использованию в указанных областях магнитного поля, а именно к способам воздействия магнитным полем на микробиообъекты и к средствам реализации этих способов.

Предшествующий уровень техники.

Использование магнитного поля в биологии характеризуется в настоящее время применением различного вида полей и их носителей.

Магнитное поле может быть постоянным или переменным. В качестве источника постоянного магнитного поля, как правило, используют подковообразные или роговидные магниты или пластины из магнитотвердых ферритов (феррит бария BaO₆Fe₂O₃, феррит кобальта CoFe₂O₄), а также из интерметаллических соединений типа самарий-кобальт (Sm₂Co₁₇). (См. например, Холодов Ю.А. Реакции нервной системы на электромагнитные поля. Москва, 1975, с. 64).

В последнее время в магнитобиологии чаще используют пульсирующие магнитные поля, где в качестве генератора применяют кольцевые электромагниты и преобразователи переменного тока в пульсирующий (cм. патент США N 3876373)/.

В указанных примерах применения воздействия магнитного поля на биообъект последний (пробирка со взвесью клеток крови, бактериальных или растительных клеток) помещается у полюсов (в межполюсном пространстве) постоянных магнитов или внутри (вблизи) катушек, сердечников и представляет собой так называемый "черный ящик", у которого известны только входные и выходные параметры.

При использовании постоянных магнитов без учета остается степень неоднородности магнитного поля, то есть направление и плотность силовых линий. Поэтому практически невозможно количественно сопоставить биологическое действие этих параметров.

В случае опытов, проводимых в переменных магнитных полях, сложно учитывать уровни вибраций (из-за пульсаций тока) и термоэффекты. В качестве же входных параметров ограничиваются паспортной характеристикой генератора, хотя в идеальном случае следует измерять поглощаемую мощность. Последний фактор также весьма трудно учесть при значительных объемах "облучаемого" препарата, при диаметре пробирок от 10 до 15 мм. Кроме этого, крайне сложно с достаточной точностью определить биологическую активность каждой составляющей электромагнитного поля.

Изложенные недостатки обусловили поиски новых видов носителей магнитного поля.

Так, авторским свидетельством СССР N 445438 было защищено воздействие на биообъект (кровеносные сосуды) магнитным носителем в виде гибкой полимерной ленты, содержащей магнитный наполнитель (оксид железа, феррит бария, самарий
кобальт).

В патентах США NN 4230685, 4331654, 4357259 в качестве магнитного носителя фигурирует суспензия, содержащая микрочастицы Fe₂O₃, альбумин и протеин А. Согласно другому патенту США N 4677067 в качестве магнитного носителя используются магнитные бактерии спириллы.

В литературе описано использование в качестве магнитного носителя полимера, содержащего микрочастицы γ Fe₂O₃ ("иммуномагнитные микробусы Дюнабидсс М-450" см. "Лимфоциты. Методы" под ред. Дж.Клауса, Москва, 1990, с.97-110). Однако для всех перечисленных видов носителей характерен существенный недостаток, заключающийся в неоднородности магнитных полей, образуемых такими носителями, и если в случаях использования постоянных магнитов или генераторов переменного магнитного поля можно ориентироваться хотя бы на их параметры, то в последних случаях утрачивается и эта возможность.

Было обнаружено, что указанных недостатков известных источников и носителей магнитного поля можно избежать, а функциональные возможности применения магнитного поля в указанных областях расширить, если в качестве источника поля использовать известную, применяемую в электронике, монокристаллическую магнитодоменную пленку, а микробиообъект приводить в непосредственный контакт с поверхностью этой пленки.

Указанная пленка широко применяется в настоящее время для изготовления запоминающих устройств вычислительных машин.

Предметом настоящего изобретения охватывается любое промышленно применимое использование указанных пленок для воздействия на микробиообъекты. Предпочтительным же является их использование для целей диагностики: микробиологической и медицинской.

Оказалось, что различные микроорганизмы (патогенные, условно-патогенные, непатогенные), будучи помещенными на поверхность магнитной пленки, по-разному реагируют на ее магнитостатическое поле, что позволяет осуществлять точную их идентификацию, и проводить экспресс-диагностику тяжких инфекционных заболеваний.

По-разному ведут себя при контакте с магнитной пленкой и клетки крови (эритроциты, лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы) человека или животного в норме и патологии, что позволяет использовать ее для скрининг-диагностики иммунных, онкологических и инфекционных заболеваний.

Преимущества микродоменной пленки при использовании ее в целях диагностики усиливаются, если использовать прозрачную пленку, в частности магнитодоменную пленку ферритграната, нанесенную путем жидкофазовой эпитаксии на прозрачную же подложку из монокристаллической керамики. В этом случае становится возможным использовать пленку в качестве предметного и покровного стекол и наблюдать за реакцией микрообъекта на магнитное поле во времени, непосредственно с помощью оптического микроскопа. В известных способах диагностики с использованием воздействия на микробиообъект магнитным полем такая возможность отсутствует, так как анализ пробы отобранной из препарата, помещенного в магнитное поле, производится вне источника поля, в результате чего происходит релаксация микроорганизмов, влияющая на точность результатов.

Другой возможной формой воздействия на микробиообъект магнитным полем магнитодоменной пленки, входящей в предмет настоящего изобретения, является использование пленки для непосредственного культивирования на ней микроорганизмов. Как показали проведенные исследования, магнитодоменные пленки ферритграната влияют на метаболическую активность микроорганизмов, то есть они могут интенсифицировать или подавлять рост колоний микроорганизмов. Если поместить на пленку труднорастущие в обычных условиях микроорганизмы, то происходящее при этом ускорение их роста позволяет ускорить и диагностику.

Культивирование микроорганизмов на магнитной пленке возможно с применением как жидких, так и плотных питательных сред. В первом случае, приготавливают взвесь культуры микроорганизма в жидкой питательной среде и наносят ее на пленку. Во втором случае, плотную питательную среду наносят предварительно на пленку, выдерживают ее при температуре 18-37^oC в течение 4-6 ч, а затем проводят посев микроорганизма.

Пример 1. Использование магнитодоменной пленки для диагностики инфекционных заболеваний.

В качестве объекта исследования для визуальной магнитной диагностики инфекционных заболеваний была выбрана бледная трепонема (Treponema pallidum), как возбудитель сифилиса (в первую очередь) и как наиболее подходящий модельный объект, характеризующийся неизометрической (палочковидной) формой бактерии (длина l_тр 10-15 мкм, толщина s_тр 0,3-0,5 мкм), наличием спиралевидной закрутки, развитым фибриллярным аппаратом, обеспечивающим многообразие и плавность движений.

Коэффициент неизометричности формы для бледной трепонемы K_тр l_тр/s_тр составляет 20-30.

В качестве объекта для диагностического исследования (теста) использовали взвесь трепонем в физиологическом растворе.

На фиг. 1 показана микрофотография Tr. pallidum на поверхности магнитодоменной ферритгранатовой пленки, имеющей ширину домена P₀₂ 3 мкм.

При визуальном наблюдении были отмечены следующие изменения в поведении микроорганизма (штамм Никольса) в магнитном поле пленки (фиг. 1а) по сравнению с контрольными условиями:
1. Фиксирование (прилипание) большинства бактерий к поверхности пленки на 15-20 минуте и их четкая параллельная ориентация относительно доменных дорожек.

2. Возникновение интенсивных колебательных движений у фиксированных трепонем (веерный контур на микрофотографиях при минутной экспозиции).

3. Раскручивание спирали трепонемы.

Сравнение поведения Tr. pallidum и непатогенной трепонемы (штамм Рейтера фиг.1в) показано, что реакции непатогенного микроорганизма на магнитное поле пленки менее выражены.

Искусственное снижение патогенности Tr. pallidum (штамм Никольса) путем длительного выдерживания анаэроба в обычных условиях также сопровождалось снижением реакции микроорганизма на поле магнитной пленки (отсутствие фиксирования, раскручивания и т.п.). На фиг. 1,б показана микрофотография штамма Никольса после 5-дневной выдержки. Веер колебаний трепонем становится уже слабо выраженным.

Повышенная адгезия к магнитной пленке патогенных трепонем в отличие от непатогенных на некоторых типах пленок обусловлена большой плотностью отрицательного заряда (полисахаридная анионоактивная капсула на ее заостренном дистальном конце) и большим объемом губчатого тела, находящегося в этой же концевой органелле, которое условно можно считать магнитосомой из-за высокой концентрации дыхательного белка цитохрома. Последний содержит ионы железа, переходящие в течение цикла из диамагнитного в парамагнитное состояние.

При старении патогенных штаммов Tr. pallidum интенсивность "дыхания" (окислительного фосфорилирования) снижается. Одновременно с этим происходит деполимеризация наружной капсулы трепонемы и, как следствие, снижение плотности отрицательного заряда. В результате снижается адгезия трепонем к поверхности магнитной пленки в "старых" штаммах.

Феноменологические факторы отличия реакции патогенных и непатогенных трепонем на магнитное поле, индуцируемое магнитной пленкой, легли в основу методики микробиологической диагностики диких и музейных штаммов Tr. pallidum для выявления в них авирулентных популяций.

Известные методы определения авирулентных популяций или, иными словами, степени патогенности бледной трепонемы, в частности по силе ее прикрепления к клеткам тканевой культуры, вводимой в среды для культивирования микроорганизма, отличаются весьма малой точностью:
подавляющая часть клеток ткани претерпевает изменения прежде, чем бактерия успевает к ним приблизиться (нет взаимодействия);
подсчет прикрепившихся бактерий для количественной оценки невозможен из-за неудовлетворительной видимости их в скоплениях;
проверка степени прикрепления путем создания капиллярных токов, проводимая нажатием на покрывное стекло, неточна (сугубо индивидуальна).

Описанный способ можно дополнить относительной оценкой метаболической активности Tr. pallidum, коррелирующей со степенью патогенности и интенсивностью колебаний на пленке данной структуры:
А_м.а.≈ П_а ≈ S(в),
где
А относительная оценка метаболической активности,
П_а степень патогенности,
S(в) площадь "веера" (негатив) при фиксированном увеличении (n),

где
α угол раскрытия веера,
l_тр длина трепонемы с учетом раскручивания,
m оптическое увеличение.

Описанный способ особенно полезен при проведении серологических реакций при диагностике сифилиса, когда необходимо проведение пассирования (перевивания) некультивируемых трепонем через культуры тканей кролика. Метод позволяет избежать "холостых" пассирований на кроликах трепонемными препаратами, утратившими по той или иной причине патогенность, что позволяет "экономить" дорогостоящих животных.

Морфологические исследования бледной трепонемы после выдержки на поверхности пленки показали, что изменения ультраструктуры бактерий под воздействием магнитного поля пленки имеют четкую специфику, зависящую от параметров магнитной пленки (ширина домена P₀₂, величина магнитного насыщения 4пМ_s) и коэффициента магнитостатической соизмеримости - соотношения максимального размера микроорганизма и ширины домена (bl_tp/ P ₀₂).

Пример 2. Использование магнитной пленки для скрининг-диагностики острых кишечных заболеваний.

Феномен повышенной адгезии к поверхности магнитодоменной пленки у патогенных бактерий по сравнению с непатогенными был использован для скрининг-диагностики острых кишечных заболеваний (дизентерия, сальмонеллез, диаррея и т.д.).

Прикрепление патогенных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл и т.п.) к поверхности магнитной пленки происходит за очень короткий срок контакта (3-5 мин), причем фиксируется подавляющее число (80-90%) клеток, в то время как облигатные микроорганизмы, такие как эшерихии, выделенные от здоровых людей, такой способностью не обладают. Как видно на микрофотографии (фиг. 2) патогенные бактерии шигеллы (возбудителя дизентерии) на поверхности пленки параллельно ориентированы и образуют парные, а иногда и тетра-ассоциаты.

Регистрацию результата осуществляют с помощью оптического микроскопа в темном поле с увеличением 500^х. Наблюдение ведут в течение 10 мин от момента нанесения капли препарата на поверхность пленки. Метод анализирует вероятность "болен-здоров" путем подсчета фиксированных клеток (прямой подсчет) или по фотографии в 3-4 полях.

При прикреплении 70-90% бактерий результат считают положительным и оставшуюся часть колонии подвергают дальнейшему микробиологическому исследованию.

Если прикрепляется меньше 20% бактерий, обследуемого считают здоровым.

Простота постановки данного экспресс-метода, возможность получения предварительного ответа через короткий промежуток времени (в 7-8 раз быстрее обычных методов), высокая чувствительность, достоверность, экономичность и минимальный набор оборудования делают метод актуальным, особенно при массовых обследованиях лиц (эпидемии, профилактические исследования декретированных групп).

Пример 3. Использование магнитодоменной пленки для тестирования клеток крови.

В результате тестирования клеток крови на магнитных пленках с различной доменной структурой были также отмечены их индивидуальные реакции на постоянное магнитное поле, индуцируемое магнитодоменными пленками.

На фиг. 3, 4, 5 показаны изменения ультраструктуры клеток крови (B-лимфоцит, макрофаг) при выдержке на поверхности магнитодоменной пленки.

Анализ микрофотографий показывает, что воздействие магнитного поля, индуцируемого пленкой на клетки, сопровождается появлением многочисленных выпучиваний (ВП) наружной мембраны, инвагинацией (ИНВ) ядерной мембраны, конденсацией и сильным уплотнением нуклеопротеида-хроматина (ХМ), составляющего основу хромосом по периферии (фиг. 3б, 4б). (Фиг. 3а, 4а - контроль).

Последнее обстоятельство указывает на то, что магнитное поле пленок, ширина домена у которых (также, как и в случае бактериальных клеток) соизмерима с размерами клеток крови, достаточно эффективно воздействует на их генетический аппарат. Подобные изменения наблюдаются, как правило, при иммунодепрессивном действии гидрокартизона.

У макрофагов в пробах, взятых от больных лейкозом, изменения были выражены ярче, чем у здоровых людей (фиг. 5), где лимфоциты при лейкозах разрушались при нанесении препарата на пленку с шириной домена P₀₂ 14,0 мкм уже на 5-8 минуте в отличие от устойчивых клеток от здоровых людей (время жизни на пленке с P₀₂ 14 мкм более 40 мин).

На фиг. 6, 7 показана кинетика трансформации эритроцитов (дискоцитов) на поверхности пленок с различной шириной домена и магнитным насыщением. При 30-минутной экспозиции эритроцитоцитарного препарата на пленках с узкими доменами (Фиг. 6) сформированные эхиноциты (Эх) составляют 32-36% а бугристые эритроциты 20-25%
На широкодоменных пленках (Фиг. 7) количество эхиноцитов после 30-минутной выдержки вдвое выше (60-67%), а количество бугристых овалоцитов (Оц) не превышает 20%
При этом в пробах, взятых от здоровых людей, не наблюдалось патологических форм эритроцитов (стоматоцитов, сфероэхиноцитов и др.). По-видимому, воздействие поля пленки играет здесь роль активатора.

Напротив, при экспозиции эритроцитарных препаратов, взятых от больных людей (или животных), наблюдались повышение содержания патологических форм вплоть до разрушения клеток, что было характерно для онкозаболеваний, в частности злокачественных опухолей желудка, и гораздо большая скорость трансформации дискоцита в эхиноцит. При такой резкой трансформации дискоцит-эхиноцит эритроциты теряют часть мембранного вещества, что делает трансформацию необратимой, а сами эритроциты приобретают сферическую форму.

В связи в этим эритроциты были выбраны маркерами при проведении скрининг-диагностики рака желудка и некоторых видов анемии.

Разработка этого класса методов с достаточно широкой классификацией: онко-, имунотяжкие инфекционные заболевания (начальный период), ВИЧ (СПИД) с учетом возможности проведения массовых обследований на крупных металлургических, химических предприятиях, шахтах из-за простоты и экспрессности способа, позволит охватывать большие регионы с напряженной экологической обстановкой.

Пример 4. Использование магнитодоменных пленок для культивирования микроорганизмов.

Как показали проведенные исследования, магнитодоменные пленки ферритграната влияют на метаболическую активность микроорганизмов, то есть они могут интенсифицировать или подавлять рост колоний микроорганизмов.

На фиг. (микрофотографии) 8 показаны размер и густота колоний клебсиеллы (Klebs. Pneumon штамм К9), выращенной на пленках ферритграната, укладываемых на дно чашки Петри, в синтетической среде в течение 48 ч. При использовании узкодоменных пленок с шириной домена 1,5-2,5 мкм (фиг. 8а) происходило явное угнетение роста по сравнению с контролем (фиг. 8б). Это объясняется большим содержанием атипичных (дегенеративных) клеток (от 30 до 50%) в облученных штаммах, что приводило к подавлению процесса деления.

Напротив, 48-часовая выдержка микроорганизмов на пленке с шириной доменов 14-20 мкм способствовала получению колоний большего размера. (Фиг. 8в).

Эта закономерность прослеживалась при культивировании возбудителей венерических заболеваний и возбудителя коклюша.

На основе полученных результатов был разработан способ диагностики с помощью магнитодоменных пленок, основанный на ускоренном выявлении труднорастущих в обычных условиях микроорганизмов, каковыми и являются вышеперечисленные микроорганизмы. В данном случае, магнитодоменная пленка является своего рода диагностикумом, позволяющим ускорить диагностику инфекционного заболевания и повысить точность определения, так как микроорганизмы в колонии обладают ярко выраженной формой, хорошей подвижностью и крупностью.

Одновременно такого типа магнитный носитель (или устройство) может быть использован для получения вакцин, так как магнитодоменная пленка вызывает увеличение биомассы с хорошо выраженными антигенными и ферментативными свойствами, особенно при осуществлении L-трансформации.

Культивирование микроорганизмов на магнитодоменных пленках согласно настоящему изобретению можно осуществлять с использованием как жидких, так и плотных питательных сред. В первом случае, приготавливают взвесь культуры микроорганизма в питательной среде и наносят ее на пленку. Во втором случае, на пленку предварительно наносят питательную среду, ингибируют ее при температуре 18-37^oC в течение 4-6 ч, а затем проводят посев на инкубированную среду культуры микроорганизма.

Заявляемые, наряду со способом воздействия магнитным полем на микробиообъекты, устройства для микробиологической или медицинской и ветеринарной диагностики и для культивирования микроорганизмов, выполненные в виде монокристаллической магнитодоменной пленки, служащей для размещения на ней, в первом случае, диагностического микробиообъекта, а во втором - питательной среды с культивируемым микроорганизмом, имеют в сравнении с традиционными устройствами для облучения биообъектов магнитным полем целый ряд существенных преимуществ, в частности:
1. Совершенство кристаллической структуры и высокая упорядоченность доменной структуры, обуславливающие отсутствие или минимальную плотность кристаллических и магнитных дефектов, что способствует высокий воспроизводимости тесте (эксперимента).

2. Малый размер элемента (толщина пленки не более 50 мкм, толщина подложки под пленкой не более 1000 мкм; габариты элемента от 5х5 до 50х50 мм; форма любая: диск, квадрат, полоска и т.п.).

3. Хорошая прозрачность, позволяющая использовать пленку при диагностике в качестве предметного и покровного стекол и наблюдать за реакцией биообъекта на магнитное поле во времени.

4. Обеспечение непосредственного контакта биообъекта с магнитодоменной пленкой, что устраняет несовпадение входных (паспортных) параметров источника и параметров в контактной зоне, и возможность при необходимости экранирования объекта экранами различной толщины.

5. Химическая инертность оксидной магнитной пленки и высокий ресурс работы (пять и более лет).

6. Возможность работы в статическом и динамическом режимах (переменное и пульсирующее магнитные поля), не меняя препарата (универсальность источника).

7. Простота аппаратурного оформления процессов воздействия на биообъект магнитным полем.

При традиционном аппаратурном оформлении процессов воздействия магнитным полем возникает необходимость помимо операции приготовления препарата, присутствующей во всех схемах, в следующих дополнительных операциях:
фиксация контейнера с препаратом относительно источника;
отбор пробы препарата;
анализ пробы.

Указанные операции требуют времени, особенно последняя, сложны для точного выполнения.

В отличие от традиционных способов создания магнитного поля по всей площади пленки индуцируется однородной биотропное магнитное поле. Это позволяет нанести капельную дозу препарата в любую зону, используя весь элемент в качестве предметного стекла.

Промышленная применимость.

Изложенные преимущества предлагаемого способа воздействия магнитным полем на микробиообъекты обеспечивают им возможности широкого применения как в научных исследованиях, в первую очередь в области микробиологии, так и в практической деятельности, причем не только в медицине и ветеринарии, но и, в частности, в биотехнологии.

Способ воздействия на микробиообъект магнитным полем, при котором в качестве источника поля используется монокристаллическая магнитодоменная пленка. 9 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Способ воздействия на микробиообъект магнитным полем, отличающийся тем, что в качестве источника магнитного поля используют монокристаллическую магнитодоменную пленку, а микробиообъект приводят в непосредственный контакт с поверхностью этой пленки. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют прозрачную магнитодоменную пленку ферритграната, нанесенную путем жидкофазовой эпитаксии на прозрачную подложку из монокристаллической керамики. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что на поверхность монокристаллической магнитодоменной пленки помещают диагностируемые пробы микробиообъектов и по разнице поведения их в магнитном поле пленки судят о состоянии микрообъекта. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве диагностируемых проб используют культуру микроорганизмов, а диагностику заболевания осуществляют по различной реакции на магнитное поле пленки патогенных, непатогенных и условно патогенных микроорганизмов. 5. Способ по п.3, отличающийся тем, что диагностику заболевания осуществляют по разнице реакции на магнитное поле пленки клеток крови человека или животного в норме и патологии. 6. Способ по пп.2 5, отличающийся тем, что прозрачную магнитодоменную пленку с находящейся на ней пробой микрообъекта используют в качестве предметного или покровного стекла или того и другого одновременно. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что монокристаллическую магнитодоменную пленку используют для культивирования на ней микроорганизмов. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что приготавливают взвесь культуры микроорганизма в жидкой питательной среде и наносят ее на магнитодоменную пленку. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что на магнитодоменную пленку предварительно наносят плотную питательную среду, выдерживают ее при 18 - 37^oС в течение 4 6 ч, а затем проводят посев культуры микроорганизма. 10. Способ по пп.4 и 7, отличающийся тем, что на магнитодоменной пленке осуществляют культивирование диагностируемых микроорганизмов.