Способ определения патогенности бледной трепонемы Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение касается вопросов бионики и магнитобиологии и может быть использовано в микробиологии при культивировании бактерий in vitro и в медицине при усовершенствовании методов диагностики.

Известны способы определения мета- биолической активности бледной трепонемы, прямым образом связанной с ее патогенностью.тю подвижности, прочности прикрепления к клеткам тканевой культуры и т.д.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения степени патогенности бледной трепонемы, включающий приготовление взвеси бледных трепонем в физиологическом растворе и условную количественную оценку степени патогенности (по длительности инкубационного периода при инфицировании кроликов).

Однако данный способ (in vivo) характеризуется сложностью, так как предусматривает проведение инъекций и наблюдение за развитием поражений (орхитов и шанкров), достаточно длителен, так как минимальная продолжительность инкубационного периода при заражении сифилисом 20 - 30 сут.

Кроме этого, предусматривает затраты на приобретение подопытных животных и их содержание. При этом в случае построения калибровочной кривой необходимо использование не менее 30 кроликов.

Целью изобретения является упрощение способа, его ускорение за счет сокращения количества подопытных животных и затрат на их содержание.

2

Ю

ы со ю

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что, как было установлено, патогенные трепонемы (в свежих препаратах), помещенные на поверхность магнитной пленки ферритграната (МПФГ), в отличие от непатогенных или культуральных трепонем, прочно фиксируются дистальным магнитомаскированным (из-за локализации в нем белка - цитохрома) концом на доменной границе МПФГ и совершают прерыви- стые колебания относительно точки фиксирования под действием выталкивающей силы постоянного магнитного поля (ПМП)соседних доменов, характеризующихся противоположной направленностью векторов намагниченности. При этом они образуют веер колебаний площадью Sb, фиксируемый при фоторегистрации.

Под влиянием ПМП бледные трепонемы раскручиваются и удлиняются в связи с по- вышенной магниточувствительностью фибриллярного аппарата, так что тр (МПП) (длина трепонемы на МПФГ)1Тр(КПР)(дли- ны трепонемы в контрольном препарате (КПР) на обычном стекле).

Специфика воздействия постоянного магнитного поля на бледную трепонему выражается в прерывистости движения (подобно часовым стрелкам), благодаря чему как веер, колебания St, так и число положений (остановок) трепонемы1 фиксируется при флоторегистрации с выдержкой длительностью т. Чем более патогенна бледная тре- понема (метаболически более активна), тем больше угол раскрытия ссь веера.

Определение степени патогенности бледной трепонемы проводят на магнитных пленках одного типа (с воспроизводимыми параметрами), сохраняющих свои свойства более одного года, т.е. пригодных для мно- горазового использования в воспроизводимых условиях. При этом пробу препарата, содержащего бледные трепонемы, наносят на поверхность МПФГ, накрывают покровным стеклом и проводят визуализацию тре- понем с последующей фоторегистрацией и определением площади веера колебаний бледной трепонемы относительно точки ее закрепления на магнитной пленке по длине трепонемы и углу раскрытия веера и рассчи- тывают по формуле параметр

А«и - Sb

пат

IV Т

где 5ь - площадь веера колебаний бледной трепонемы на поверхности МПФГ55

Sb- S lO ObC-f-}2,

где а- угол раскрытия веера; 1тр - длина трепонемы;

m - оптическое увеличение при визуализации и фоторегистрации в темном поле микроскопа;

п - число дискретных положений при фоторегистрации;

г-длительность выдержки при фоторегистрации.

Усредненную величину А{ пат находят путем обработки изображений не менее 200 особей, содержащихся в препарате.

Поскольку величина параметра А пат коррелирует со степенью патогенности бледных трепонем, содержащихся в препарате, то она может быть использована для определения степени патогенности бледной трепонемы в иследуемом препарате (выраженной, например, в длительности инкубационного периода после заражения кроликов), на основании предварительно полученной калибровочной кривой.

П р и м е р . В качестве предметной подложки в процессе определения степени патогенности бледной трепонемы в препаратах используют прозрачную пластину, на рабочей поверхности которой нанесена МПФГ толщиной 2 мкм.

Штамм патогенных трепонем или серум, взятый от больного, разбавляют физиологическим раствором или средой 199 в растворе Хенкса так, чтобы исходная концентрация бледных трепонем составляла 1000- 1500 особей.

Пластину с нанесенной на ней магнитной пленкой укладывают на предметный столик микроскопа Биолам Р17 рабочей стороной кверху.

Каплю препарата объемом 0,02 - 0,03 мл с помощью мерной микропипетки переносят на поверхность МПФГ, после чего ее накрывают покровным стеклом и выдерживают 5 мин, затем проводят визуализацию бледных трепонем с одновременной фоторегистрацией изображения при выдержке 60с.

Патогенными трепонемами считают те трепонемы, которые совершают колебательные движения относительно точки фиксирования,сопровождающиеся образованием характерного веера при длительной выдержке (тьтд не менее 60 с).

Непатогенными трепонемами считают те трепонемы, которые не совершают колебательных движений в магнитном поле МПФГ.

После фотосъемки определяют путем геометрических измерений угла раскрытия веера аь, длине бледной трепонемы (Тр и количество положений при колебании п при

рассматривании изображения бледной тре- понемы на поверхности МПФГ.

Далее определяют расчетные параметры Зь, и А ®Пат по приведенным выше формулам.

Корреляцию количественного показателя А 2 пат проводят путем сопоставления с длительностью.инкубационного периода заражения кроликов и величиной шанкров.

Степень патогенности бледных трепо- нем в данном случае зависит от времени хранения препаратов в стандартных условиях. Так, показатель А пат в свежих препаратах после 1-2-суточного хранения находится на уровне 20 - 1510 с; после 5-10-суточного хранения степеньЪа- тогенности снижается в 2.5 - 3 раза.

Те препараты, в которых содержится 50 - 70% трепонем со степенью патогенности 15 - мкм2- , дают минимальный срок заражения и ярко выраженные шанкры величиной более 3 см.

Таким образом, изобретение позволит изучать на популяционном уровне эпидоб- становку и прогнозировать течение эпидемического процесса.

Формула изобретения Способ определения патогенности бледной трепонемы, включающий приготовление суспензии исследуемой культуры в физиологическом растворе с последующим ее тестированием и количественной оценкой, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, исследуемую суспензию наносят на поверхность магнитной пленки ферритграната, накрывают покровным стеклом и проводят микроскопическое исследование с фоторегистрацией изображения, а оценку ведут по величине площади веера колебаний бледной трепонемы относительно точки ее закрепления на магнитной пленке, которую рассчитывают по длине трепонемы и углу раскрытия веера.

Использование: медицина, медицинская диагностика, магнитобиология, бионика. Сущность изобретения: трепонемы помещают на поверхность магнитной плен 2 ки ферритграната и определяют с помощью микроскопа с фоторегистрами веер колебаний изображения трепонем относительно точки их фиксирования на магнитной пленке. Величина угла раскрытия веера колебаний коррелирует со степенью патогенности бледной трепонемы. Каплю препарата наносят на рабочую поверхность магнитной пленки ферритграната толщиной 2 мкм, нанесенной на поверхность прозрачной пластины, накрывают покровным стеклом. Выдерживают 5 мин, визуализуют в микроскопе с фоторегистрацией изображения при выдержке 60 с. На полученном изображении путем геометрических измерений опре- деляют средние параметры веера колебаний препарата бледной трепонемы и оценивают ее патогенность. 1 пр. (Л С