СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В БИОПТАТЕ HELICOBACTER PYLORI ПРИ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/62 C12Q1/10 C12Q1/58 

Изобретение относится к области медицины, а точнее к медицинской микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики гастродуоденальной патологии, ассоциированной с Helicobacter pylori, на основании обнаружения указанных микроорганизмов в биоптатах, извлеченных в процессе эндоскопии, и определения их бактериальной обсемененности.

Известен способ обнаружения H.pylori по гидролизу мочевины и изменению цвета индикатора pH среды при диагностике вызываемых указанными микроорганизмами поражений гастро-дуоденального отдела (Hernandez F. Rivera P. Sigaran M. Miranda J. Diaguosis of Helicobacter pylori comparison of ureasa test, histological visualization of curved bacteria and culture //Rew Just. Meg. trop. Sao Paulo, 1991, т. 33, N 1, p. 80-82). Для этого в пробирку с 200 мкл 10% раствора мочевины и 0,2% раствора фенолового красного погружали биоптат и инкубировали при 37^oC в течение 10 мин. Через указанный промежуток времени при наличии H.pylori в исследуемом материале и расщеплении ими мочевины происходило подщелачивание среды в пробирке с изменением цвета раствора на розовый. Это расценивалось в качестве положительного результата исследования. Специфичность теста достигала 83% чувствительность 72% Недостатком описанного метода является то, что изменение цвета индикатора происходит при изменении pH. В основе последнего, однако, может лежать не только обусловленное H. pylori подщелачивание среды в результате гидролиза мочевины и образование NH₃, но и целый ряд других неконтролируемых факторов, что существенно снижает специфичность описанного теста.

Цель изобретения повышение чувствительности теста, сокращение времени исследования.

Указанная цель достигается благодаря использованию реактива Несслера и мочевины в определенном соотношении.

Способ определения в биоптате Helicobacter pylori при гастродуоденальной патологии включает инкубирование биоптата в смеси 10% раствора мочевины и реактива Несслера при их объемном соотношении в реакционной смеси 0,3 (0,1-0,2), соответственно, в течение 5-10 мин при температуре 25^oC. В случае наличия в исследуемом материале H.pylori происходит расщепление мочевины с образованием аммиака, что обусловливает появление вокруг биоптата желто-коричневого кольца или желто-бурого осадка на дне пробирки. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна степени бактериальной обсемененности материала. В отсутствие микроорганизмов цвет системы не изменяется. Преимуществом описанного способа является повышение чувствительности до 100% ввиду использования мочевины, являющейся субстратом для уреазы H.pylori и образующей в качестве конечного продукта NH₃. Последний легко обнаруживается даже в незначительных количествах (2,5•10^-7 г) при помощи реактива Несслера. Интенсивность окраски позволяет дифференцировать степень бактериальной обсемененности: 1 степень (слабая) до 20 микробных клеток, 2 степень (умеренная) до 50 микробных клеток и 3 степень (выраженная) свыше 50 микроорганизмов в исследуемом материале, что необходимо для косвенной оценки тяжести заболевания. Все это осуществляется при температуре 25^oC, а следовательно, исключает необходимость использования дополнительного лабораторного оборудования и позволяет осуществлять диагностику непосредственно в кабинете эндоскопии.

Реактив Несслера представляет собой раствор тетраиодогидратгидрата калия и KOH, образующий с ионами NH₃ желто-бурый осадок.

Мочевина (х/ч) представляет собой белое кристаллическое вещество (карбамид, CO( Н₂)₂, М.м. 60,1, температура плавления 135^oC, температура кипения разлагается), хорошо растворимое в воде и спиртах, нерастворимое в эфире, бензоле, хлороформе.

Было обследовано 27 детей, у 16 из них эндоскопически выявлен гипертрофический, у 9 эрозивный и у 2 поверхностный гастрит. В 16 случаях гастриту сопутствовала язва 12-перстной кишки. Контрольную группу составили 10 детей без эндоскопической патологии.

В результате исследования биоптатов детей опытной и контрольной групп по описанному выше способу было установлено, что материал от 10 детей контрольной группы не обусловливал изменения цвета в тест-системе. В опытной группе во всех случаях имело место желто-бурое окрашивание среды различной степени интенсивности. В 5 случаях вокруг биоптатов образовалось желто-коричневое "кольцо", что соответствовало слабой степени обсемененности материала H. pylori. Биоптаты 12 детей через 3 мин обусловливали появление желто-бурого "кольца" и образование к 5-ой мин инкубирования желто-бурого осадка, что соответствовало умеренной бактериальной обсемененности материала. Инкубация биоптатов 10 детей в предложенной реакционной смеси явилось причиной образования осадка уже через 2-3 мин, что соответствовало выраженному микробному обсеменению исследуемого материала. Полученные в опытной и контрольной группах результаты были подтверждены гистологически и серологически, на основании чего была установлена этиология гастродуоденальной патологии и проведена соответствующая этиотропная терапия.

Пример 1. Больной Н. (мальчик 12 лет) обратился по поводу болей в области эпигастрия и тошноты. В процессе эндоскопии визуально обнаружен гипертрофический гастрит. Для выяснения этиологии заболевания и проведения этиотропной терапии осуществлена биопсия. Биоптат внесли в стерильную пробирку, асептично добавили 0,3 мл 10% раствора мочевины в бидистиллированной воде и 0,1-0,2 мл реактива Несслера. Смесь инкубирована при 25^oC. Через 2 мин установлено появление желто-бурого осадка, что соответствовало выраженному бактериальному обсеменению материала. Диагносцирована гастродуоденальная патология, связанная с Helicobacter pylori.

Предложенный способ увеличивает специфичность реакции /в отношении/продуктов гидролиза субстрата для уреазы/ и ее чувствительность до 100% в то время как по прототипу чувствительность составляет 72% Применение способа определения в биоптате Helicobacter pylori при гастродуоденальной патологии необходимо для своевременного выявления носителей, для связанных с ними заболеваний на доклиническом этапе в процессе проф.осмотров и для проведения высокоэффективной этиотропной терапии.

Использование: в медицинской микробиологии, для определения в биоптате Helicobacter pylori при гастродуоденальной патологии. Сущность изобретения: способ включает инкубирование биоптата в смеси 10 % раствора мочевины с реактивом Несслера при их объемном соотношении 0,3 : (0,1 - 0,2), соответственно; обсемененность биоптата Helicobacter pylori определяют по появлению желто-коричневого кольца вокруг биоптата как слабую, желто-бурого кольца, переходящего в желто-бурый осадок, как умеренную, и желто-бурого осадка, как выраженную. Предложенный способ увеличивает специфичность реакции и ее чувствительность до 100%, вследствие чего повышается точность диагностики.

Способ определения в биоптате Helicobacter pylori при гастродуоденальной патологии, включавший инкубирование биоптата в смеси 10%-ного раствора мочевины и индикатора с последующей оценкой его обсемененности, отличающийся тем, что в качестве индикатора используют реактив Несслера при объемном соотношении его и мочевины в реакционной смеси 0,1 0,2 0,3 соответственно, а обсемененность биоптата Helicobacter pylori определяют по появлению желто-коричневого кольца вокруг биоптата как слабую, желто-бурого кольца, переходящего в желто-бурый осадок, как умеренную и желто-бурого осадка как выраженную.