СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТРАГАСТРАЛЬНОЙ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С HELICOBACTER PYLORI Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в гастроэнтерологии для индикации Helicobacter pylori и определения степени бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка при хеликобактерных гастритах, гастродуоденитах и язвенной болезни.

Известен способ определения интрагастральной уреазной активности, ассоциированной с Helicobacter pylori [1]. Указанный способ включает взятие пробы желудочного содержимого в объеме 0,3 мл и помещение ее в стерильную пробирку вместе с мочевинусодержащим диском (из наборов СИБ производства Горьковского НИИЭМ). В верхнем конце пробирки закрепляют индикаторную бумагу на аммиак. Пробирки помещают в термостат при t=37^oC на 24 часа. Появление розовой или красной окраски свидетельствует о положительной реакции на уреазу Н. pylori. Отсутствие изменения окраски среды свидетельствует об отрицательной реакции. Интенсивность образования NН₃ в среде дополнительно контролируется тест-полосками индикаторной бумаги на определение NН₃. Недостатком данного способа является качественный, а не количественный характер определения уреазы, а также низкий уровень чувствительности способа (13,3%) при сопоставлении его с цитологическим исследованием. Последнее связано с тем, что желудочное содержимое имеет кислую реакцию и само по себе способно затруднить диссоциацию индикатора. Следует также отметить, что в случае проведения визуальной оценки изменения окраски среды при слабой степени бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка бактериями H.pylori небольшую степень диссоциации индикатора можно не заметить. Кроме того, время реакции длительно (24 часа) и требует дополнительного использования лабораторного оборудования для постоянного поддержания температуры на уровне 37^oС.

Известен способ определения интрагастральной уреазной активности H.pylori при выделении колоний самого микроорганизма из биопсийного материала слизистой оболочки желудка [2]. Выполняется указанный способ следующим образом. В течение 4-5 дней из биопсийного материала, полученного во время эндоскопии на селективном агаре в микроаэрофильных условиях выращиваются культуры микроорганизма. После их идентификации культура погружается в забуференный до рН 7 раствор мочевины (с концентрацией 20 ммоль/л) и концентрация аммония, образовавшегося в результате реакции, измеряется NH₃-селективным электродом и соотносится с сухим весом бактерий за единицу времени (микромоль NН₃/мг бактерий/минуту).

Недостатком данного способа является необходимость получения колоний микроорганизмов, что также требует длительного времени (4-5 суток) и значительных финансовых затрат на селективную среду и специализированное лабораторное оборудование (микроанаэростат и селективные NН₃-электроды). Кроме того, H.pylori характеризуется низким процентом выделения культур (44 - 54%) вследствие "капризности" микроорганизма, крайне чувствительного к малейшим колебаниям параметров в процессе проведения культурирования.

Из всех известных способов наиболее близким к изобретению по совокупности признаков является способ определения интрагастральной уреазной активности H.pylori с использованием желудочного содержимого у пациентов с язвенной болезнью и хроническим гастродуоденитом [3]. Способ выполняется следующим образом: у пациента откачивают базальную порцию желудочного содержимого, фильтруют и готовят инкубационную смесь из 0,3 мл фильтрата желудочного содержимого и 0,3 мл 0,05% раствора мочевины, приготовленного на 0,25 М фосфатном буфере (рН 7). Через 1 час к 0,2 мл смеси добавляется 1 мл 2% раствора диметила-минобензальдегида с целью остановки реакции. Смесь встряхивают и инкубируют еще 30 минут, затем колориметрируют на микро ФЭК при желтом фильтре в кювете с объемом 1 мл. В качестве контроля используют смесь, состоящую из 0,1 мл исследуемого желудочного содержимого, 0,1 мл 0,25 М фосфатного буфера (рН 7) и 1 мл диметиламинобензальдегида. Интрагастральную уреазную активность рассчитывают по формуле А= 7В/9, где А - активность уреазы в ед/л, В - количество мочевины в микрограммах, гидролизованной за 30 минут 0,1 мл желудочного содержимого. Концентрацию мочевины определяют по калибровочному графику, отражающему разведения мочевины от 75 до 300 мкг/мл.

Недостатками указанного способа являются:
зонд при введении его в желудок через ротовую полость загрязняется контаминантной микрофлорой ротовой полости, обладающей собственной уреазной активностью, что потенциально обусловливает низкую специфичность данного способа (65%);
низкий процент содержания мочевины в диагностической среде (0,05%), потенциально затрудняющий детекцию микроорганизма;
полученные показатели не отражают величину бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка пациента, инфицированного Н. pylori;
необходимость каждый раз готовить стерильный раствор реагентов ex tempora;
необходимость постоянного участия дополнительного персонала в связи со сложной технологической последовательностью процесса;
необходимость калибровочной кривой для постоянного расчета концентраций субстрата реакции.

Технический результат - повышение специфичности способа, возможность проведения полуколичественного анализа бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка, упрощение способа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: у больного берут биопсийный фрагмент слизистой оболочки желудка, погружают его в коммерческий раствор ("De-Nol test", Yamanouchi Europe b.v., Лейдердорп, Нидерланды). "De-Nol test" (Yamanouchi Europe b.v., Лейдердорп, Нидерланды) представляет собой коммерческий 6% раствор мочевины, предназначенный для качественного обнаружения уреазы микроорганизмов и в первую очередь Helicobacter pylori. Упаковка содержит 20 запечатанных пробирок объемом 1 мл с реагентом. Срок годности - 9 месяцев от даты изготовления. Хранение в холодильнике не требуется. Использование четырехчасового периода инкубации биопсийного фрагмента в диагностической среде позволяет обнаружить интрагастральную уреазную активность у пациентов даже с минимальной степенью бактериальной заселенности слизистой оболочки желудка. Инкубационную смесь подвергают экспозиции продолжительностью 4 часа, а затем колориметрируют на ФЭК при длине волны 540 нм и соотносят оптическую плотность с временем инкубации биопсийного фрагмента и весом биопсийного фрагмента (единицы оптической плотности / мг биопсийного материала / минуту). Для лучшей стандартизации результаты умножают на 1000. Контролем служит раствор "De-Nol test" без погружения биопсийного материала.

Анализ результатов позволяет выявить зависимость между величиной интрагастральной уреазной активности по предлагаемому способу и стандартной шкалой обсемененности слизистой оболочки желудка Н.pylori по Л.И. Аруину, а также позволяет дифференцировать величину обсемененности с высокой степенью статистической достоверности. Определение обсемененности проводят следующим образом
при показателях уреазной активности от 1,5 до 4 единиц оптической плотности/мг биопсийного материала/минуту определяется слабая степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori;
при показателях уреазной активности от 5 до 10 единиц оптической плотности/мг биопсийного материала/минуту определяется умеренная степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori;
при показателях уреазной активности от 11 до 19 единиц оптической плотности/мг биопсийного материала/минуту определяется высокая степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori.

Общими для предлагаемого объекта изобретения и прототипа существенными признаками являются: забор биоматериала желудка, смешивание биоматериала с диагностической средой, содержащей мочевину в качестве субстрата реакции и оценка результата с использованием фотоэлектроколориметра по изменению оптической плотности диагностической среды после инкубации с изучаемым биоматериалом.

Основными отличиями заявляемого способа являются:
использование в качестве биоматериала желудка биопсийных фрагментов слизистой оболочки, позволяющее избежать контакта изучаемого биоматериала с ротовой полостью и ее секретом, за счет их изоляции в стерильном канале эндоскопа;
использование высокого процента содержания мочевины в диагностической среде (6%), что увеличивает надежность идентификации H.pylori;
соотнесение оптической плотности диагностической среды, содержащей исследуемый биоматериал, со временем инкубации и весом самого биопсийного фрагмента;
возможность полуколичественной оценки плотности бактериального заселения слизистой оболочки желудка H.pylori;
использование стандартного коммерческого стерильного раствора "De-Nol test", упрощающего процесс подготовки диагностической среды к процедуре;
упрощение технологии процесса, не требующее дополнительного участия персонала на период проведения реакции;
простота интерпретации результата, не требующая построения калибровочной кривой концентраций субстрата реакций, поскольку результат выражается в единицах оптической плотности.

Сравнение заявляемого решения не только с прототипом, но и с другими решениями в данной области науки показало, что оптимальными диагностическими параметрами обладает 6% раствор мочевины, причем ложно-положительных результатов, зависящих от наличия других микроорганизмов (протей, клебсиелла) даже при внесении их в диагностическую среду в концентрации 10⁷ не наблюдается [4, 5].

Выявленные признаки, отличающие заявляемый способ, позволяют сделать вывод о соответствии критерию "изобретательский уровень". Приведенная совокупность существенных признаков в литературе не описана.

Пробы биопсийного материала от 90 пациентов, извлеченные в процессе фиброгастроскопии, исследовали на наличие интрагастральной уреазной активности, ассоциированной с H.pylori инфекцией. Полученные данные верифицировали гисто- и цитологически, серологически (наборы "Anti-H.pylori EIA, Roche, Швейцария) и при помощи полимеразной цепной реакции на обнаружение фрагмента ДНК H. pylori кодирующего синтез субъединицы А уреазы микроорганизма. Верификация диагноза позволила выявить H.pylori инфекцию у 70 пациентов и ее отсутствие у 20 пациентов.

Величина интрагастральной уреазной активности у семидесяти H.pylori-позитивных пациентов составила 9,45±2,98 единиц оптической плотности / мг биопсийного материала / минуту, а у двадцати H.pylori-негативных пациентов - 0,25±0,11 единиц оптической плотности / мг биопсийного материала / минуту. Согласно данным статистического анализа (тест Стьюдента) различие достоверно (р<0,001). Величины показателей интрагастральной уреазной активности в сопоставлении со степенью бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка Н.pylori представлены в таблице.

Вследствие своей технологической простоты и доступности лабораторного оборудования предлагаемый способ может быть использован в любой биохимической лаборатории, где имеется фотоэлектроколориметр. Предлагаемый способ наряду с клинической практикой может успешно применяться в научных исследованиях для изучения влияния интрагастральной уреазной активности in vivo на различные параметры человеческого организма (морфологические сдвиги и т.д.).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная Ирина В., 11 лет, обратилась в клинику с жалобами на боли в области пупка и в эпигастральной области, возникающие через 2 часа после приема пищи, а также отрыжку, тошноту и изжогу. При проведении фиброгастроскопии обнаружена язва угла желудка, диаметр 5 мм, а также язва двенадцатиперстной кишки, диаметр 8 мм, в сочетании с гипертрофическим гастритом. После тестирования биопсийного материала по описанному способу была определена интрагастральная уреазная активность - 9,21 единиц оптической плотности / мг биопсийного материала / минуту, что соответствует умеренной степени обсемененности слизистой оболочки желудка Н.pylori. При цитологическом, серологическом и молекулярно-биологическом исследовании диагноз H.pylori инфекции был подтвержден. При сопоставлении величины показателя с визуально-аналоговой шкалой Л.И. Аруина обнаружена умеренная степень бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка.

Пример 2. Больная Мария З., 9 лет, обратилась в клинику с жалобами на боли в области пупка, не связанные с приемом пищи и горький вкус во рту. При проведении фиброгастроскопии обнаружен поверхностный гастродуоденит с признаками дуодено-гастрального рефлюкса III степени. После тестирования биопсийного материала по описанному способу была определена интрагастральная уреазная активность - 3,3 единицы оптической плотности / мг биопсийного материала / минуту, что соответствует слабой степени бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori. При цитологическом, серологическом и молекулярно-биологическом исследовании диагноз H.pylori инфекции был подтвержден. При сопоставлении величины показателя с визуально-аналоговой шкалой Л.И. Аруина обнаружена слабая степень бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка.

Проведенное исследование свидетельствует о том, что предложенный способ определения интрагастральной уреазной активности, ассоциированной с H.pylori, является эффективным и надежным, как в диагностике Н.pylori инфекции, так и в определении степени бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка вышеуказанным микроорганизмом.

Источники информации
1. Баженов Л.Г., Саидханов Б.А., Ходжаева Н.У. // Определение C.pylori у больных с гастродуоденальной патологией // Лаб. дело 1990, 10, с. 71-73.

2. Shallcross T.M., Wyatt J.I., Millar M.R., Heatley R.V. // Is urease activity a virulence factor for C.pylori? // Klin. Wochenschr. 1989, vol. 67 (Suppl. 18), p. 63-64.

3. Масевич Ц.Г., Соколовский В.В., Пак С.Ф. // Диагностика кампилобактерной инфекции у больных с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки // Клин. мед. 1989, 11, с. 80-81.

4. Баженов Л.Г. // Методы выделения и идентификации Campylobacter pylori // Лаб. дело 1991, 1, с. 48 - 53.

5. Vaira D., Holton J., Cairns S. et al. // Urease tests for Campylobacter pylori: care in interpretation // J. Clin. Pathol. 1988, vol. 41, 7, p. 812 - 813.

Способ может быть использован в медицине, а именно в медицинской микробиологии и гастроэнтерологии для индикации Helicobacter pylori и определения степени бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка при хеликобактерных гастритах, гастродуоденитах и язвенной болезни. У больного берут биопсийный фрагмент слизистой оболочки желудка, погружают его в коммерческий раствор. Инкубационную смесь подвергают экспозиции, колориметрируют на ФЭК при длине волны 540 нм и соотносят оптическую плотность с временем инкубации биопсийного фрагмента и весом биопсийного фрагмента (единицы оптической плотности /мг биопсийного материала/ минуту). При значении уреазной активности от 1,5 до 4 единиц определяют слабую степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori, при ее значении от 5 до 10 единиц определяют умеренную степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori, а при ее значении от 11 до 19 единиц определяют высокую степень обсемененности слизистой оболочки желудка H.pylori. Способ обладает специфичностью, дает возможность проведения полуколичественного анализа бактериальной обсеменности слизистой оболочки желудка. 1 табл.

Способ количественной оценки инфицированности слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori (НР), включающий забор биоматериала желудка, смешивание его с диагностической средой, содержащей раствор мочевины в качестве субстрата реакции, с последующим колориметрированием диагностической среды, определением уреазной активности и оценкой результата по изменению оптической плотности диагностической среды после инкубации с изучаемым биоматериалом, отличающийся тем, что в качестве биоматериала используют биоптат слизистой оболочки желудка, определяют уреазную активность как соотношение оптической плотности диагностической среды к единице веса биоптата (мг) за единицу времени (мин) и при ее значении от 1,5 до 4 единиц определяют слабую степень обсемененности слизистой оболочки желудка НР, при ее значении от 5 до 10 единиц - умеренную степень обсемененности и при значении от 11 до 19 единиц - высокую степень обсемененности слизистой оболочки желудка НР.