СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА ПО ОЦЕНКЕ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/00 

Описание патента на изобретение RU2184781C2

Изобретение относится к разделу аналитической химии, связанному с медико-биологическими исследованиями, а именно с определением уреазной активности, и может быть использовано как в микробиологии, так и в медицине, в частности, для диагностики хеликобактериоза.

Хеликобактериоз - одна из наиболее распространенных в мире инфекций, вызываемая Helicobacter pylori и проявляющаяся хронической гастродуоденальной патологией. Helicobacter pylori (хеликобактер) отличается чрезвычайно высокой уреазной активностью. Определение уреазной активности биоптатов, извлеченных из слизистой желудка в ходе эндоскопического обследования, наряду с гистологическими и микробиологическими исследованиями (Л.И. Аруин, П.Я. Григорьева и др. "Хронический гастрит", Амстердам, 1993, 362 с.) служит важным аспектом диагностических исследований. Кроме того, используются серологические методики и биохимичееские методики (Н. В. Сафонова, А.В. Жебрун "Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз", Рекомендации для врачей, НИИ им. Пастера, Спб,1993, 40 с.), в том числе выполняемые in vivo: для контроля содержания равновесного аммиака колориметрическим методом с накоплением на зернистом хемосорбенте выдыхаемого аммиака без приема пациентом карбамида (Хеликобактериоз: Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Материалы международного симпозиума. СПб, 1995, с 74-84.) и кинетическими методиками с использованием колориметрического метода и метода спектрометрии ионного дрейфа для контроля изменения содержания аммиака в воздухе ротовой полости пациента после приема внутрь карбамида нормального изотопного состава (E.Kornienko, О. Vashkevich, V. Mileiko, V. Samokish, Simple Express urea breath test offers diagnosis of Helicobacter pylori infection; International Congress on Analytical Chemistry, Moscow, June 15-21 1997; abstracts, v. 2, P-37) или ополаскивании раствором карбамида ротовой полости пациента (В.Л. Пайков, А. И. Иванов, Предварительные результаты исследований уреазной активности полости рта у детей с Helicobacter pylori ассоциированным гастродуоденитом. Пятая сессия Российской группы по изучению Helicobacter pylori, Омск, 20-21 мая 1997 г.: Материалы сессии, с 47-49.), приеме внутрь карбамида меченного изотопами 14С (Peura D.A.,Pambianco D.J., Dye K.R., et al. Microdose urea breath test offers diagnosis of in 10 minutes. Am. J. Gastro. 1996; 91 (2), р. 233-238), 15N ( Krumbiegel P., [15N2]Urea urine test to study Helicobacter pylori infection of children in Leipzig. Workshop of EU Research Proect, 14-17.12.1995 St. Jones College Cambridge, UK in: Annual Activity Report 1995, "Application of stable isotopes in clinical medicine" BMH1 CT93, Jan. 1996.) или 13C (Logan R.P., Polson R. J., Miseiewicz J.J. et el. Simplified single sample 13 carbon urea breath test for Helicobacter pylori: comparithion with Histologi, culture and ELISE serology; Gut., 1991; 32, р. 1461-1464).

Уреазную активность, как in vivo, так и in vitro обычно измеряют по кинетике разложения мочевины и, в частности, по количеству аммиака или углекислого газа (Дж.Б. Самнер, Г.Ф. Сомерс, "Химия ферментов и методы их исследований", под ред. В.А. Энгельгардта, Иностранная литература, Москва, 1948, 584 с, с.178), выделяющихся в результате реакции ферментативного гидролиза:

Для исследований in vitro подбор реакционной среды, откуда углекислый газ (СО2) удаляется в большей мере, чем аммиак, получил большее распространение для диагностики хеликобактериоза биохимическими тестами (Е.М. Стародуб и др. "Геликобактериоз и язвенная болезнь" Минздрав РСФСР, ЛенНИИ Э и М им. Пастера, Тернопольский ГМИ, Л. , 1991, 32 с, с 19). Для определения уреазной активности биоптатов чаще всего используются различные жидкие среды, приготовляемые ex tempore из растворов, содержащих мочевину в воде, 50% этаноле или фосфатном буфере с кислотно-основным индикатором, обычно феноловым красным (рН перехода 6,8-8,4). Общеизвестна среда Христиансена: мочевина 20 г/л, феноловый красный 0,012 г/л, KH2PO4 2г/л, пептон 1 г/л, NaCl 5 г/л, глюкоза 10 г/л. Именно эта среда была впервые применена для определения HP в биоптатах слизистой оболочки желудка. Более удачна среда, содержащая 2 г мочевины, 10 мг фенолового красного и азида натрия в 100 мл 0,01М фосфатного буфера рН 6,5 (Н.В. Сафонова, А.В. Жебрун "Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз", Рекомендации для врачей, НИИ им.Пастера, Спб, 1993,40 с., с.32).

Наиболее важными серийными тестами на основе красителей (рН-индикаторов) являются "Pyloritek" (B.J. Marshall and coil. Rapid urease test in the management of Campylobacter pyloridis-associated gastritis. Am. J. Gastroenterol. 1987;v. 82, p.200-210; Westblom T.U. and coll. Evaluation of a rapid urease test to detect Campylobacter pylori infectim. J. Clin. Microbiol., 1988, v. 26, p.1393-1394) и коммерческий CLOtest, выпускаемый фирмой "Delta West"(Австралия) совместно с фирмой "Tri-Med Specialites Inc." (США).

В последнем в качестве реакционной среды используется агаровый гель, который содержит мочевину в качестве реагента и феноловый красный в качестве индикатора. Он наиболее близок к заявляемому конструктивно. Специфичность этого теста - 100%, чувствительность - 95%, время анализа 3 часа (Halli M., Zimaity Т., Al-Assi M.T., Genta R..M., Graham D.Y. Confirmation of Successful Therapy for Helicobacter pylori infection: Number and Site of Biopsies for Rapid Urease Test. The American Journal of Gastroenterology, 1995, v. 90, p. 1962-1964).

В CLOtest и аналогичном ему Campy-test (Григорьев П.Я., Исаков В.А., Розенталь В. М. и др., Авторское свидетельство СССР 1564192, С 12 Q 1/04 от 18.04.88 "Способ определения Campylobacter pyloridis при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки) использованы плотные гелеобразные носители среды, изготовленные в виде таблетки. Такие тесты не требуют дополнительного времени на подготовку аналитической процедуры, просты в использовании, отличаются высокой чувствительностью и специфичностью. В качестве плотного носителя обычно используется агар, а в качестве консерванта - азид натрия. Для одного анализа используется питательная среда в количестве 0,05-0,15 мл, содержащая мочевину 15-25 г/л, фосфатный 0,01М буфер рН 6,5 и индикатор феноловый красный ≈500 мг/мл.

Недостатками CLOtest и подобных ему тестов являются длительность анализа (1-3 часа), необходимость создания особых условий при использовании (Т=40oС) и достаточно высокая стоимость (в Великобритании CLOtest стоит 3,25 $ на одно исследование). Как временные, так и температурные ограничения обусловлены главным образом использованием в качестве плотного носителя однородного геля на основе агара.

Другим аналогом, наиболее близким к заявляемому по техническим характеристикам, является Де-Нол Тест, предлагаемый на Российском рынке фирмой Яманучи Юэроп Б.В. в виде двухкомпонентной однорастворной системы, также содержащей в качестве основных реагентов мочевину и феноловый красный. Высокое качество (чувствительность и хранимость) достигается в первую очередь за счет стерильной упаковки сухого лиофилизированного реагента (Рекламный проспект Яманучи Юэроп Б.В.). Специфичность этого теста 97%, чувствительность 95%, время анализа 15 мин (рекламный проспект фирмы).

Недостатками Де-Нол Тест являются наличие предварительной работы при подготовке теста к анализу (растворение реагента в растворителе непосредственно перед проведением аналитической процедуры) и относительно высокая стоимость теста (2,5 $ на одно исследование).

Наконец, общим недостатком всех вышеописанных тестов является использование в качестве индикатора фенолового красного, который имеет довольно высокую границу перехода (от рН 6,8 до рН 8,4 ), что занижает чувствительность аналитической реакции. Использование индикатора с несколько меньшим значением рН-перехода позволяет зафиксировать в реакционной среде меньшие количества свободного аммиака и, следовательно, зафиксировать меньшие количества энзима, катализирующего гидролиз мочевины до аммиака и углекислого газа.

В то же время для выполнения аналогичных процедур широко известны различные реактивные бумаги (М.И. Бережная, Н.Л. Костенок, П.П. Гура и др.. Бумага - основа для изготовления реактивных и диагностических бумаг. Авторское свидетельство СССР 1390285, опубл. 24.04.1988, D 21 Н 5/20, G 01 N 31/22), которые, хотя и не являются прямыми аналогами при создании тест-систем для контроля уреазной активности, с точки зрения волокнистых материалов вполне пригодны и для создания на их основе других биохимических тестов. Использование новых материалов для биохимических тестов (В.И. Кузнецов, Состав для приготовления индикаторной бумаги для определения солей органических кислот. Авторское свидетельство СССР 1254362 от 19.05.1983, G 01 N 21/78) и устройств капиллярной сорбции (Elbert V. Kring, Gaseous contaminant dosimetr with diffusion device therefor and method, US Patent 4208371, опубл. 17.06.1980, В 01 D 53/22, В 01 D 59/10, G 01 N 31/22, G 01 N 33/00), обычно применяемых при создании пассивных дозиметров, наряду с применением зернистых сорбентов на основе стекла, ситаллов, оксида алюминия, двуокиси кремния (силикагеля), фарфора, каолина, цеолитов и других твердых носителей (Е.А. Перегуд, М.С. Быховская, Е. В. Гернет. Быстрые методы определения вредных веществ в воздухе. : изд. второе, М.: Химия, 1970, 360 с, с 59-65.) дает основу для новых разработок применительно к уреазным биохимическим тестам, пригодным в частности для диагностики хеликобактериоза.

Поэтому с целью дальнейшего упрощения аналитической процедуры, уменьшения времени проведения анализа, расширения аналитических возможностей, снижения стоимости исследования в медико-биологической практике нами для широкого использования предлагается уреазный тест на основе твердого гигроскопичного пористого или зернистого носителя.

В зависимости от способа применения тест, содержащий в качестве реагента мочевину (карбамид) в количестве от 0,2 г до 5,0 г на 1 дм2, а в качестве индикатора - один из кислотно-основных индикаторов с интервалом перехода в области от рН 3,2-5,0 до 8,2-9,0 в количестве от 1 г до 20 г на 1 дм2, может быть выполнен в виде реактивной бумаги или реактивной текстильной ленты, разрезанной на тест-билеты, коаксиальных систем (трубок или плоских дисков с отверстием в середине) сфероидов (с одним, несколькими или большим количеством отверстий, если тест покрыт непроницаемым полимером). Тест обычно не содержит иных добавок, кроме веществ, повышающих сорбцию или хранимость. Тесты хранятся как в традиционной упаковке: стеклянных банках или пластиковых пробирках с крышкой или пробкой, так и в индивидуальной упаковке из полимерного материала (полипропилена, полиэтилена, поливинилхлорида, полиэфира и т.д.) или стекла.

В составе тест-системы может использоваться фосфатный или иной аналогичный ему кислотно-основной буфер, как совмещенный в одном объеме с мочевиной или ее раствором, так и разделенный пространственно или посредством специального устройства. При этом как раствор карбамида, так и другие растворы, входящие в индикаторную рецептуру, могут быть предварительно ампулированы для использования ex tempore или нанесены на твердый сорбент заранее. В случае, когда один или более из реагентов ампулированы, твердый сорбент может не содержать в своем составе мочевину, индикатор или группу дополнительных реагентов.

В случае проведения анализа по определению уреазной активности слюны, мочи или другой биологической жидкости, тест может иметь неразъемное покрытие из полимерного материала. Кроме того, тест может быть использован для оценки содержания аммиака в воздушной среде.

Пример 1. Бумагу для биохимических тестов (М.И. Бережная, Н.Л. Костенок, П. П. Гура и др., Бумага - основа для изготовления реактивных и диагностических бумаг. Авторское свидетельство СССР 1390285, опубл. 24.04.1988, D 21 Н 5/20, G 01 N 31/22) последовательно пропитывают указанными ниже растворами, избыток раствора отжимают и бумагу высушивают после каждой стадии пропитки.

Раствор 1 - водный раствор мочевины, содержащий 2 г карбамида на 100 мл воды.

Раствор 2 - раствор бромтимолового синего в количестве 3 мг на 100 мл этанола.

Сушку проводят в сушильном шкафу при температуре 98-100oС.

Полученную реактивную бумагу разрезают на участки 10-25 мм2 и используют для биохимических тестов следующим образом.

Для построения градуировочной зависимости берут стандартный образец уреазы, например, Urease производства Merc Саt 8489 CARN [9002-13-5] с известной активностью по Самнеру [Sumner J.B.; J.Brit. Chem., v. 9, 435 (1926); Sumner J.B., Hand O.B.; J. Brit. Chem. v. 76, p. 149 (1928)], взвешивают навеску 0,10 мг и растворяют в 100 мл воды. Из полученного раствора последовательными разбавлениями готовят серию градуировочных растворов с содержанием уреазы 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 и 1,0 мг/л.

Мандреном на участок бумаги наносят каплю каждого градуировочного раствора и фиксируют время развития цветного пятна (индикационного эффекта) размером 1 мм2 (кинетический метод) или исследуют соответствие цветовому эталону (появление светло-фиолетового пятна размером 2 мм на светло-желтом фоне) за время 5 мин для раствора 0,3 мг/л (при этом раствор 0,2 мг/л не дает несомненный эффект за 5 мин или меньшее время).

Для анализа уреазной активности биологической жидкости иглу мандрена или другой пробоотборник помещают в биологическую жидкость (раствор, суспензию или эмульсию) и каплю жидкости наносят на участок бумаги. Затем фиксируют время появления пятна, соответствующего цветному эталону, и по градуировочной зависимости оценивают активность анализируемого образца.

В другом случае, если важен сам факт наличия у анализируемого образца уреазной активности, об этом судят по проявлению индикационного эффекта - пятна, соответствующего цветовому эталону, за 5 мин.

Для диагностики хеликобактериоза по уреазной активности Helicobacter pylori биоптат, изъятый из антрального отдела желудка в ходе эндоскопического обследования и биопсии, помещают на участок реактивной бумаги и фиксируют время. Через 5 минут фиксируют наличие индикационного эффекта - светло-синего пятна. Наличие синей окраски бумаги в месте контакта ее с биоптатом свидетельствует о высокой уреазной активности образца, связанной с присутствием в биоптате хеликобактеров в патологическом количестве.

При наличии высокой обсемененности эффект развивается уже за первые 30 с начала контакта биоптата с реактивной бумагой.

Пример 2 отличается от примера 1 тем, что реактивную бумагу (хлопковая или сульфатная предгидролизная целлюлоза для кордных нитей (20-35%), вискозное волокно (60-70%) и поливинилспиртовое волокно (5-10%) пропитывают раствором 2 мл бромфенолового синего в 10% водном растворе мочевины в воде и сушат при температуре 98-100oС до 2-3%-ной влажности.

Для анализа уреазной активности биологического образца, содержащего твердую фазу или иную взвесь, образца, содержащего коллоидную составляющую, суспензию или эмульсию, или же биоптата его приводят в контакт с участком реактивной бумаги и контролируют возникновение индикационного эффекта (синего на желтом фоне) во времени.

Результаты анализа совпадают с результатами по примеру 1. Тест-система имеет аналогичные описанной в примере 1 характеристики.

Пример 3 отличается от примера 2 тем, что пропитку проводили раствором реагентов в 94-96%-ном этаноле (70 г/л мочевины и 75 мг/л бромфенолового синего), а сушку проводили при 78-100oС.

Для анализа уреазной активности биологического образца, представляющего собой твердую фазу, или биоптата его приводят в контакт с участком реактивной бумаги и смачивают биоптат каплей дистиллированной воды или фосфатного буфера рН 7,0 (Ю.Ю. Лурье. Справочник по аналитической химии. Изд.6, - М.: Химия, 1989, 448 с., с.271).

Результаты анализа совпадают с результатами по примеру 1. Тест-система имеет характеристики, аналогичные характеристикам тест-системы, описанной в примере 1.

Пример 4 отличается от примера 3 тем, что пропитку индикатором проводили из метанола с добавкой уксусной кислоты (0,1 мг уксусной кислоты на 1 мл метанола), а сушку проводили в герметичном устройстве, снабженном холодильником и сборником метанола для повторного его использования.

Тест-система имеет характеристики, аналогичные описанной в примере 1, но индикационный эффект более контрастен.

Пример 5 аналогичен примерам 1-4 и отличается тем, что сушку проводили при более низкой температуре под вакуумом, а перед пропиткой к раствору индикатора для его лучшего растворения был добавлен раствор аммиака по каплям до начала цветового перехода индикатора. Тест-система обладает более высокой впитывающей способностью. Однако развивающийся во времени индикационный эффект менее контрастен.

Пример 6. Пример отличается тем, что процесс проводили аналогично примерам 1-3 с той лишь разницей, что сушку пропитанных бумаг проводили на открытом воздухе, носитель предварительно пропитывали раствором лимонной кислоты в количестве 0,2 мг на 1 дм2, а совместно с индикатором наносили тетраэтиламмоний хлорид в количестве 0,4 мг на 1 дм2. Тест-система обладает пониженной хранимостью (гарантированный срок сохраняемости не более шести месяцев), но позволяет получить яркий и контрастный индикационный эффект.

Причем, в случае анализа биоптатов, при стандартизации их размеров развивающийся кольцевой индикационный эффект может быть оценен количественно по размеру пятна или фотоденсиметром по электронному спектру пропускания или отражения.

Пример 7. Все операции проводили аналогично примеру 3 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован феноловый красный и индикационный эффект соответствовал желто-красному переходу, а к раствору индикатора был добавлен тетрабутиламмоний хлорид.

Хотя тест-система имеет аналогичные описанной в примере 1 характеристики, развивающийся во времени индикационный эффект менее контрастен. (Однако тест-система отличается более быстрым срабатыванием на идентичные количества уреазы.)
Пример 8. Аналогичен примеру 3 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован тимоловый синий, а совместно с карбамидом в ходе пропитки дополнительно вносилась щавелевая кислота в количестве 0,1 мг на 1 дм2 носителя. Затем индикаторную бумагу, изготовленную, как описано выше, покрывают по поверхностям полимерной пленкой из полиэтилена высокого давления и разрезают на тест-билеты размером 20-30 мм2. При этом полимерная прозрачная в видимом свете полимерная пленка плотно приклеивается к бумажному носителю за счет слоя бутилкаучука, предварительно нанесенного на полимерную пленку с одной стороны. Изготовленная тест-система была свободна с торцов для проникновения жидкости за счет капиллярного эффекта и легко смачивалась слоем жидкости. Для диагностического анализа на уреазную активность с целью диагностики HP тест-систему вносили в ротовую полость пациента и приводили в контакт со слюной. За 1-2 с целлюлозный носитель полностью смачивался и на нем развивалась индикаторная реакция. Билет, окрасившийся в синий цвет, свидетельствовал о уреазной активности слюны.

Пример 9. Аналогичен примеру 7 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован фенолфталеин, при этом время анализа, требующееся для появления аналогичного цветового эталона (красное пятно диаметром 1 мм), увеличено до 1 часа. Для диагностики хеликобактериоза у пациентов отбирали слюну мандреном и в количестве одной капли наносили на тест-билет. У 9 из 10 пациентов, у которых ранее хеликобактериоз был диагносцирован другими методами (В. Л. Пайков, А.И. Иванов, Предварительные результаты исследований уреазной активности полости рта у детей с Helicobacter pylori ассоциированным гастродуоденитом. Пятая сессия Российской группы по изучению Helicobacter pylori, Омск, 20-21 мая 1997 г., Материалы сессии, с. 47-49.), тест зафиксировал высокую уреазную активность.

Пример 10. Аналогичен примеру 9 с той лишь разницей, что в качестве индикатора использован крезолфталеин. Для контроля уреазной активности микрофлоры в ротовой полости отбирали пробу зубного налета и наносили его на тест-билет. Индикационный эффект размыт и развивается медленнее. Тест-система обладает более высокой хранимостью (гарантированный срок сохраняемости не менее восьми месяцев).

Пример 11. Аналогичен примеру 7 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован о-крезолсульфофталеин. Для оценки наличия уреазопродуцентной микрофлоры использовали биоптат ткани из ротовой полости. Индикационный эффект при наличии такой микрофлоры развивается медленнее чем в предыдущем случае.

Пример 12. Аналогичен примеру 2 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован м-нитрофенол, а совместно с карбамидом наносили ацетат натрия в количестве 0,5 мг на 1 дм2 бумаги. Индикационный эффект проявляется в виде желтого пятна на белом фоне. Индикационный эффект размыт и развивается медленнее.

Пример 13. Аналогичен примеру 2 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован хинолиновый синий, а пропитку проводили из 50% водного этанола. При этом индикационный эффект фиолетового цвета развивается медленнее.

Пример 14. Аналогичен примеру 9 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован фенолсульфофталеин. Тест имеет близкие технические характеристики.

Пример 15. Аналогичен примеру 7 с той лишь разницей, что в качестве индикатора была использована розоловая кислота, которую наносили из водного раствора, содержащего 2 мг/мл буры, 1 мг/мл борной кислоты и 10 мг/мл коллоидной гидроокиси серебра. Тест-система имеет аналогичные технические характеристики, но обладает более высокой хранимостью (гарантированный срок сохраняемости не менее восьми месяцев).

Пример 16. Аналогичен примеру 12 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован п-нитрофенол. Тест имеет аналогичные технические характеристики.

Пример 17. Аналогичен примеру 12 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован о-нитрофенол. Тест имеет аналогичные технические характеристики.

Пример 18. Аналогичен примеру 7 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован дибром-о-крезолсульфофталеин. Тест имеет аналогичные технические характеристики.

Пример 19. Аналогичен примеру 13 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован нитразан желтый, совместно с которым наносили сульфат аммония в количестве от 0,1 до 0,3 мг на 100 мг индикатора. Тест имеет более низкие технические характеристики.

Пример 20. Аналогичен примеру 7 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован дибромфенолсульфофталеин и хлористый аммоний в количестве от 0,1 до 0,3 мг на 100 мг индикатора. Тест имеет аналогичные технические характеристики.

Пример 21. Аналогичен примеру 1 с той лишь разницей, что в качестве бумаги был использован фильтркартон, который был обработан дополнительно нитратом висмута в количестве 3 мг на 1 дм2 фильтркартона. Тест имеет аналогичные характеристики при анализе жидких сред и заниженные диагностические показатели при анализе биоптатов, так как характеризуется низкой адсорбционной способностью по отношению к аммиаку.

Пример 22. Аналогичен примеру 1 с той лишь разницей, что в качестве пропитываемого материала была использована фильтровальная бумага, дополнительно обработанная хлоридом кальция (3 мг на 1 дм бумаги), из водного раствора в ходе пропитки карбамидом. Тест-система малопригодна для анализа жидких сред, так как носитель легко размокает. Лучшие аналитические характеристики получены при анализе капли прозрачного раствора.

Пример 23. Аналогичен примеру 2 с той лишь разницей, что в качестве пропитываемого материала использовалась текстильная (атласная или хлопчатобумажная) лента. Тест малопригоден для анализа биоптатов, но имеет высокие технические характеристики при анализе жидких и коллоидных сред, суспензий и эмульсий с более высоким рН (6,8<рН<8,5), так как носитель выполняет роль буфера.

Пример 24. Текстильную атласную ленту шириной 16 мм, намотанную на барабан (или катушку), обрабатывают индикаторной рецептурой, как это описано в примерах 1-20, затем текстильную ленту покрывают оптически инертным полимером с двух сторон термосклейкой или за счет липкого слоя (например, полиэтилен с липким слоем бутилкаучука). Полученная лента разрезается на участки - тест-билеты. Каждый тест-билет может быть дополнительно покрыт слоем полимера для его полной герметизации.

Для проведения аналитических измерений тест-билет ребром, по разрезу, приводится в контакт с биоптатом или на секунду помещается in vitro в биологическую жидкость (или слюну in vivo). Возникающий индикационный эффект контролируют через приведенное выше время. Наличие эффекта указывает на уреазную активность. Контрольное время, соответствующее уреазной активности инфицированного хеликобактером, соответствует 5 минутам.

Пример 25 отличается от примера 1 тем, что бумагу для биохимических тестов пропитывали только раствором 2, а биоптат смачивали каплей 10% раствора мочевины в фосфатном буфере рН 7,0 (жидкую биологическую пробу разбавляли в соотношении 1: 2). Результаты для сухих биоптатов превышают описанные в примере 1 по достоверности анализа.

Пример 26 отличается от примера 25 тем, что аналитическую процедуру проводили в замкнутом объеме (пластиковой одноразовой пробирке с пробкой).

Пример 27. Аналогичен примеру 26 с той лишь разницей, что биоптат размещался на дне пробирки в капле раствора мочевины в фосфатном буфере, а участок реактивной бумаги (тест-билет) - над слоем жидкости в газовой среде. При этом индикационный эффект развивался за 5-10 минут на всей поверхности бумаги в том случае, если биоптат обладал уреазной активностью, связанной с инвазией Helicobacter pylori, и не развивался за 24 часа, если таковая отсутствует.

Пример 28. Аналогичен примеру 24 с той лишь разницей, что на текстильную ленту наносили только бромфеноловый синий из спиртового раствора (3 мг в 100 мл), отжимали и сушили на воздухе при 60oС, затем разрезали на элементы и изготавливали тест-билеты склейкой двух слоев полимерной ленты с липким слоем. Перед аналитической процедурой тест-билет вскрывали по линии отреза и помещали в закрытую емкость, где на дне находился биоптат, смоченный 10%-ным раствором мочевины в фосфатном буфере рН 8,0, или исследуемый биологический раствор (желудочный сок, желудочное содержимое), разбавленный в соотношении 1: 2 10%-ным раствором мочевины в фосфатном буфере рН 8,0. Билет был прикреплен к крышке и отделялся от жидкой среды газовой фазой.

Возникающий при наличии уреазной активности индикационный эффект развивается линейно от линии разреза вглубь билета фронтально. Ширина окрашенной полосы развивается симбатно возрастающей уреазной активности образца (биоптата). Наличие полосы более 1 мм через 5 минут свидетельствует о высокой уреазной активности и в случае анализа биоптата, изъятого в ходе биопсии при эндоскопическом обследовании желудка и/или двенадцатиперстной кишки по поводу инвазии Helicobacter pylori.

Пример 29. Аналогичен примеру 28 с той лишь разницей, что водный раствор, которым производилась пропитка, содержала сульфат магния в количестве 1 г на 100 мл раствора, что улучшало сорбционные свойства материала и чувствительность определения при работе с сухим биоптатом.

Пример 30. Аналогичен примеру 1 с той лишь разницей, что пропиточный раствор содержал 5 мг НСl.

Пример 31. Все операции проводили аналогично примеру 28, текстильную ленту обрабатывали бромтимоловым синим из водного раствора, в котором первоначально при рН выше 8,0 растворяли индикатор (3-5 мг на 100 мл воды), а затем перед пропиткой доводили до рН 6,0-6,2 добавкой 0,01н раствора НСl по каплям, ориентируясь на сине-желтый переход индикатора. При этом чувствительность и хранимость по сравнению с примером 28 возрастает.

Пример 32. Аналогичен примеру 31 с той лишь разницей, что в качестве индикатора был использован феноловый синий, а пропитка производилась из спиртово-водного раствора (20% этанола в воде) индикатора, подкисленного до рН 3,0-3,2 0,1н раствором НСl по каплям. При этом изготовленный таким образом тест-билет использовался как для анализа in vitro (описано выше в примерах 27,28), так и для анализов in vivo. При этом пациент принимал 10 мл 5% раствора мочевины перорально; запивал, прополаскивая рот, 10 мл дистиллированной воды и через 5 минут вносил в ротовую полость тест-билет, придерживая его пальцами или, в случае, когда тест-билет размещен внутри полиэтиленовой, фторопластовой или полипропиленовой защитной трубки, - губами. Через 5 минут измерялась ширина появившейся синей полосы. Появление такого индикационного эффекта свидетельствует об уреазной активности, связанной с инвазией Helicobacter pylori. Ширина изменившего окраску слоя характеризует степень инвазии.

Пример 33. Аналогичен примеру 1 с той лишь разницей, что пропиточный раствор содержит 0,3% глицерина.

Пример 34. Аналогичен примеру 2 с той лишь разницей, что пропиточный раствор содержит 0,5% глицерина.

Пример 35. Аналогичен примеру 32 с той лишь разницей, что бромфеноловый синий, выбранный в качестве индикатора, нанесен известным способом на подготовленный известным способом силикагель (Байбаков Ф.Б., Шарапов В.М. Контроль примесей в сжатых газах. - М.: Химия, 1989.-160 с: ил. с.78-79.), а карбамид нанесен на целлюлозный порошковый носитель пропиткой из водного раствора и последующей сушкой при комнатной температуре. Целлюлозный носитель с торца помещен в полимерную трубку диаметром 2 мм и длиной 100 мм плотным слоем высотой 5 мм. Выше этого слоя находится ватный тампон толщиной 1-2 мм с плотно прилегающим к нему слоем сорбента (кислый силикагель с рН 2-4 с нанесенным на него кислотно-основным индикатором). Индикатор закреплен с другой стороны ватным тампоном толщиной 1-2 мм.

Для диагностических исследований анализируемая жидкость (слюна, желудочный сок, дуоденальное содержимое) приводится в контакт с впитывающим целлюлозным носителем и быстро смачивает его. Карбамид под действием микробной уреазы гидролизуется, выделяющиеся газообразные продукты проникают в слой зернистого хемосорбента и изменяют его цвет с желтого на сине-фиолетовый.

Пример 36 проводили аналогично примеру 35 c той лишь разницей, что вместо целлюлозного сорбента использован силикагель КСК с размером зерна 0,16-0,25 мм, обработанный карбамидом посредством виброобработки.

Пример 37 отличается от примера 3 тем, что в качестве носителя использовали сорбент на основе окиси алюминия с размером зерен 0,08-0,125 мм, из которого были изготовлены тест-билеты на полимерной (терефталатной) основе, на которой зерна закреплялись бутилкаучуком.

Пример 38 отличается от примера 35 тем, что в качестве индикатора был использован бромтимоловый синий, а мелкодисперсный волокнистый целлюлозный материал пропитывался карбамидом из фосфатного буфера и высушивался при температуре 70-80oС. Тест-система смешивалась с мелкодисперсным полипропиленом в виде смеси порошков и прессовалась термопрессовкой при температуре 80-90oС и давлением от 400 до 800 кг/см2 в таблетки или гранулы как единое целое.

Пример 39 отличается от примера 1 тем, что в качестве твердого сорбента, пропитывающегося в ходе аналитического исследования биологической жидкостью, использовались стеклянные микросферы, помещенные в стеклянную трубку диаметром 5,5 мм, длиной 100-110 мм и толщиной стенки 0,5 мм и закрепленные слоем волокнистого сорбента с обеих сторон. Аналитические реагенты (цитратный буфер, раствор карбамида и индикатора в воде, предварительно заключенные в стеклянные ампулы диаметром 4 мм и длиной 14-16 мм) помещены выше слоя сорбента и разделены между собой стеклянным кольцом, находящимся внутри трубки (Байбаков Ф. Б., Шарапов В.М. Контроль примесей в сжатых газах.- М.: Химия, 1989. -160 с: ил., с.57, рис. 4.1.). Стеклянная трубка может быть герметизирована запайкой с двух концов для хранения. Для определения уреазной активности биологического образца или образца воды трубку вскрывают с двух сторон и на 1-2 с помещают в анализируемую жидкость или биологический образец помещают на слой сорбента. Затем ампулу разбивают ампуловскрывателем, выполненным в виде металлического штыря, и смачивают ампулированными реагентами. На сорбенте начинает развиваться индикационный эффект, характеризующий уреазную активность (бактериальную зараженность) исследуемого образца.

Пример 40. Все процедуры проводили аналогично примеру 39 с той лишь разницей, что в качестве волокнистого материала используется супертонкое волокно, способное задерживать частицы аэрозоля из воздуха. При аспирировании через индикаторную трубку воздуха атмосферы, воздуха отсека обитания, воздуха рабочей зоны или воздуха, выдыхаемого человеком или животными, со скоростью 0,1-2,0 л в 1 мин на сорбенте фиксируется аэрозоль, содержащий микроорганизмы, а после смачивания сорбента реагентами развивается индикационный эффект, характеризующий наличие уреазоактивной микрофлоры в образце воздуха.

Пример 41 отличается от примера 39 тем, что ампула с реагентами и бумажный тест-билет находятся внутри полиэтиленового пакета, куда в ходе анализа помещается биоптат. После чего ампула разрушается механическим воздействием и на билете через 5 минут фиксируется индикационный эффект.

Пример 42. Аналогичен примеру 40 с той лишь разницей, что конструкция исполнена в виде тест-билета и ампул, совмещенных внутри полимерного пакета. Билет выполнен из бумаги на основе стекловолокна.

Пример 43. Текстильную капроновую ленту или полотно обрабатывают индикаторной рецептурой без использования растворителей из "взвешенного или кипящего слоя" реагентов (мелкодисперсного кристаллического карбамида совместно с мелкокристаллическим индикатором) или как это описано в примерах 1-20, затем ленту покрывают прозрачным полимером с двух сторон или наклеивают термосклейкой с одной стороны на твердый полимерный материал, а с другой стороны наклеивают непроницаемое прозрачное полимерное покрытие. Полученная лента (полотно) разрезается на участки - тест-билеты. Каждый тест-билет может быть дополнительно покрыт слоем полимера для его полной герметизации.

Для проведения аналитических измерений дополнительное покрытие снимается, тест-билет ребром, по разрезу, приводится в контакт с биоптатом или на секунду помещается in vitro в биологическую жидкость (или слюну in vivo) и контролируют возникновение индикационного эффекта во времени. Наличие индикационного эффекта, соответствующего цветному эталону, или скорость нарастания оптической плотности, превышающая скорость, выбранную в качестве диагностического критерия, характеризует наличие уреазной активности. Отсутствие индикационного эффекта за время более трех часов свидетельствует об отсутствии уреазной активности. Контрольное время, соответствующее уреазной активности инфицированного хеликобактером, соответствует пяти минутам. Количественная оценка может производится как визуально, так и оптикоэлектронным методом.

Пример 44. Аналогичен примеру 43 с той лишь разницей, что текстильную хлопчатобумажную ленту 16 мм, намотанную на катушку, обрабатывают индикаторной рецептурой, протаскивая ленту через фторопластовую камеру, снабженную высокооборотной мешалкой активаторного типа, куда шнековым питателем постоянно подаются индикатор и карбамид. При этом активатор выполняет роль размалывающего элемента (диспергатора) и смесителя одновременно. Таким образом, размол, смешение и нанесение индикаторной рецептуры совмещены и выполняются одновременнно. Электростатические явления, возникающие при трении реактивов о фторопласт, способствуют адгезии мелкокристаллических частиц текстильным материалом. Затем текстильную ленту покрывают полимером с двух сторон за счет липкого слоя (например, терилен с липким слоем бутилкаучука). Полученная лента разрезается на участки - тест-билеты. Изготовленные таким образом тест-билеты по своим техническим характеристикам превосходят аналоги, изготовленные по примеру 24.

Пример 45. Аналогичен примеру 28 с той лишь разницей, что в качестве твердого носителя использовали силикагель марки КСМ с размером зерен 0,25-0,40 мм. Сорбент обрабатывали индикатором, растворенным в водном 50%-ном этаноле, сушили при температуре 60oC - во времени между слоями полимерного материала, прозрачного в видимой области. Индикационный эффект (длина окрашенного слоя) имеет большие габаритные размеры, но граница цветового перехода размыта.

Пример 46. Аналогичен примеру 28 с той лишь разницей, что твердый зернистый сорбент помещали в стеклянную трубку внутренним диаметром 5 мм и закрепляли его тампонами из стекловаты или стекловолокна. Индикационный эффект, контролируемый визуально, имеет более контрастную границу цветового перехода.

Пример 47. Аналогичен примеру 45 с той лишь разницей, что в качестве сорбента был взят силикагель марки КСК с размером зерен 0,10-0,16, а в качестве ограничивающих слой сорбента фиксирующих пористых проницаемых для аммиака материалов использовались ватные тампоны из хлопковой тонковолокнистой ваты. При этом индикационный эффет имеет меньшие линейные размеры (высоту изменившего с желтого на синий цвет окрашенного столба хемосорбента), но имеет более четкую, чем для тест-систем по примерам 28 и 45 границу перехода.

Пример 48. Силикагель марки КСК (100 г) обрабатывают водным раствором карбамида (100 мл 10%-ного раствора), сушат при температуре 70-80oС. Затем пропитывают обработанный сорбент 50 мл спиртового раствора индикатора (1 мг/мл тимолового синего), и тщательно перемешивая, сушат на воздухе при температуре 60-70oС до сыпучего состояния. Сорбент помещают в стеклянную трубку высотой 50-60 мм и диаметром 2,45-2,55 мм так, чтобы сорбент заполнил весь ее объем. Сорбент закрепляется за счет ватных тампонов высотой 3-4 мм. Тампоны выполняются из ваты, обработанной карбамидом (1:100 по весу). Причем один из тампонов содержит только карбамид, а другой дополнительно содержит 2 мг кристаллической уреазы бобов сои в качестве внутреннего стандарта.

Для выполнения аналитической процедуры по оценке уреазной активности биологического образца (жидкости, коллоида, суспензии или эмульсии) тест-систему помещают каждой из сторон на 5-6 с в анализируемую жидкость.

Пример 49. Аналогичен примеру 24 с той лишь разницей, что материал носителя, заключенный между слоями полимерного материала, выполнен из бумаги для биохимических тестов. Причем часть билетов содержит под полимерным покрытием дополнительно кристаллическую уреазу в количестве 1 мг, 2мг, 3 мг, 5 мг, 10 мг, 30 мг, 100 мг и 600 мг на каждые 25 мм2 (то есть в одном билете). Билеты собраны в стопки, чтобы они представляли собой единый блок, состоящий из аналитических и эталонных тестов, составляющих единую аналитическую систему (пакеты). Пакет может быть заключен в единый корпус. Аналитическая процедура по анализу биологического объекта (биоптата или жидкой пробы) выполняется следующим образом: билеты в составе пакета торцевой поверхностью приводятся в контакт с анализируемым образцом так, чтобы в них равномерно проникла жидкая фаза, а затем через установленный промежуток времени, например 1 минута, индикационный эффект теста, не содержащего заведомую пробу уреазы, сравнивается с возникшей индикационной шкалой. По соответствию индикационного эффекта на аналитическом тест-билете одному или нескольким из эталонных судят об уреазной активности анализируемого образца.

С помощью теста, изготовленного по примеру 1, было обследовано 750 больных с хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны (хронический гастрит, язвенная болезнь) и 45 здоровых в возрасте от 6 до 65 лет. Во всех случаях диагноз был подтвержден эндоскопически. Результаты гистологических исследований на Helicobacter pylori, данные нагрузочного дыхательного теста (Корниенко Е. А,, Милейко В.Е. Новый метод неинвазивной диагностики хеликобактериоза. Диагностика и лечение, 1996,11(12), с 31-33.) и серологические исследования антител к Helicobacter pylori в крови в 98% совпадали с результатами анализов биоптатов по примеру 1.

Результаты по специфичности и чувствительности теста, рассчитанные на основании этих обследований, составляют 98% и 96% соответственно. Время исполнения аналитической процедуры не превышало 5 минут.

Тест пригоден и для других исследований и по чувствительности и специфичности не уступает аналогам, но превосходит их по экспрессности, простоте выполнения аналитической процедуры, технологичности изготовления и экономическим характеристикам. Кроме того, проведение аналитической процедуры тест-билетами, выполненными по примерам 1-3, позволяет использовать тот же биоптат для других исследований (морфологических и т.п.) после проведения биохимических исследований.

Похожие патенты RU2184781C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА ИН ВИВО 1996
  • Корниенко Елена Александровна
  • Милейко Виктор Евгеньевич
RU2100010C1
СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ 1998
  • Иванов А.В.
  • Милейко В.Е.
RU2176792C2
Тест-система для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку 2018
  • Дмитриенко Марина Александровна
  • Аксенов Евгений Матвеевич
  • Дмитриенко Вадим Сергеевич
  • Коломина Елена Олеговна
RU2715405C1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ УРЕАЗОПРОДУЦИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ "БЫСТРЫЙ УРЕАЗНЫЙ ТЕСТ ГЕЛИКОБАКТЕР ТЕСТ" И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ 2013
RU2540473C2
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА 1993
  • Жебрун А.Б.
  • Сафонова Н.В.
  • Довгаль С.Г.
  • Милейко В.Е.
  • Фаловский М.В.
RU2091796C1
Заготовка для изготовления тест-системы для проведения экспресс-диагностики инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности биоптата и способ изготовления тест-системы 2016
  • Аксенов Евгений Матвеевич
  • Дмитриенко Вадим Сергеевич
  • Киреев Андрей Игоревич
RU2630651C9
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ HELICOBACTER PYLORI У БОЛЬНЫХ С ХИРУРГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ ОРГАНОВ БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ 2009
  • Сеньчукова Марина Алексеевна
  • Тукманбетов Ринат Маратович
  • Суздалев Николай Михайлович
  • Сафронов Григорий Александрович
  • Мельников Олег Викторович
  • Воронов Дмитрий Юрьевич
  • Глухов Дмитрий Владимирович
RU2440583C2
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ ЖЕЛУДКА, ВЫЗВАННОЙ HELICOBACTER PYLORI 2013
  • Бушуева Елена Андреевна
  • Плисс Михаил Гениевич
  • Плисс Михаил Михайлович
  • Горбачева Ирина Анатольевна
  • Шестакова Людмила Андреевна
RU2521340C1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ HELICOBACTER PYLORI ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОБУСЛОВЛЕННОЙ ИМИ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ 1993
  • Нижевич А.А.
  • Очилова Р.А.
  • Сатаев В.У.
  • Мавзютов А.Р.
  • Булгаков А.К.
  • Габидуллин З.Г.
RU2084533C1
Способ выявления онкологических заболеваний и устройство для его осуществления 2020
  • Милейко Виктор Евгеньевич
  • Альпер Григорий Александрович
  • Норейка Владас Альгимантасович
  • Дзебисашвили Георгий Тамазович
RU2755073C1

Реферат патента 2002 года СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА ПО ОЦЕНКЕ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретения относятся к медико-биологическим исследованиям, связанным с контролем уреазной активности биоптатов и биологических жидкостей с целью оценки их бактериальной обсемененности, в частности Helicobacter pylori. Способ исследования включает оценку уреазной активности по величине или времени возникновения индикационного эффекта цветной реакции, протекающей на твердом сорбенте в результате взаимодействия кислотно-основного индикатора и продуктов реакции гидролиза карбамида - аммиака под действием эндогенной уреазы микроорганизмов. Аммиак сорбируют твердым капиллярным или зернистым сорбентом. Способ реализован в устройстве, позволяющем проводить экспресс-анализ биоптатов, биологических жидкостей, аэрозолей. Карбамид и кислотно-основной индикатор нанесены на твердый гигроскопический волокнистый или зернистый микрокапиллярный сорбент в виде однородной мелкокристаллической дисперсии. Результаты исследований не уступают аналогам, но превосходят их по экспрессности и простоте выполнения. Изобретение позволяет использовать биоптат для других исследований после проведения биохимических исследований. 2 с. и 8 з.п. ф-лы.

Формула изобретения RU 2 184 781 C2

1. Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала, включающий воздействие карбамида на анализируемый биологический материал, адсорбцию реакционной среды и образующегося в результате гидролиза карбамида аммиака и визуальный контроль колориметрической реакции кислотно-основного индикатора, отличающийся тем, что аммиак сорбируют твердым капиллярным волокнистым или зернистым сорбентом. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве реакционной среды используют жидкую фазу анализируемого биологического материала, адсорбированную капиллярным волокнистым или зернистым сорбентом, причем аммиак, выделившийся в процессе реакции, адсорбируют другим твердым сорбентом. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве реакционной среды используют исследуемый биологический материал, причем карбамид вносят в кристаллическом виде или в виде раствора, аммиак адсорбируют твердым волокнистым сорбентом и фиксируют кислотно-основным индикатором с рН перехода от 3,0-3,2 до 6,8-9,0. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что биологический материал и твердый сорбент разделяют воздушной средой. 5. Устройство для диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала, содержащее карбамид, кислотно-основной индикатор и адсорбент аммиака, удерживаемые на носителе, отличающееся тем, что карбамид и кислотно-основной индикатор нанесены на твердый гигроскопический волокнистый или зернистый микрокапиллярный сорбент в виде однородной мелкокристаллической дисперсии. 6. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что гигроскопический волокнистый материал дополнительно обработан уреазой, кислотами, основаниями или солями. 7. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что кислотно-основной индикатор нанесен на твердый гигроскопический волокнистый сорбент, а карбамид в кристаллическом виде или в виде 5-10% раствора отделен в самостоятельную герметичную упаковку. 8. Устройство по п. 7, отличающееся тем, что карбамид упакован в ампулы или капсулы в виде 10% водного раствора в фосфатном буфере рН 7,0. 9. Устройство по п. 4, отличающееся тем, что оно выполнено в виде реактивной бумаги на целлюлозной основе. 10. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что карбамид и кислотно-основной индикатор нанесены на адсорбент из газовой среды в электростатическом поле, создаваемом трением.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2002 года RU2184781C2

Реагент для обнаружения белка в моче 1976
  • Вальтер Риттерсдорф
  • Вернер Гютляйн
  • Вольфганг Вернер
  • Ханс-Георг Рей
  • Петер Рикманн
SU633501A3
САФРОНОВА Н.В
и др
Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз
Рекомендации для врачей, НИИ им.Пастера, СПб, 1993
с
Способ образования коричневых окрасок на волокне из кашу кубической и подобных производных кашевого ряда 1922
  • Вознесенский Н.Н.
SU32A1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ HELICOBACTER PYLORI ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОБУСЛОВЛЕННОЙ ИМИ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ 1993
  • Нижевич А.А.
  • Очилова Р.А.
  • Сатаев В.У.
  • Мавзютов А.Р.
  • Булгаков А.К.
  • Габидуллин З.Г.
RU2084533C1
Способ обнаружения уробилиногена 1972
  • Вальтер Риттерсдорф
  • Дитер Бергер
  • Ханс-Георг Рей
  • Петер Рикманн
SU535914A3
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ГАСТРИТА, АССОЦИИРОВАННОГО С HERICOBACTER PYLORI 1991
  • Нижевич А.А.
  • Годун Б.С.
  • Сатаев В.У.
  • Еникеева С.А.
RU2069699C1

RU 2 184 781 C2

Авторы

Дмитриенко М.А.

Корниенко Е.А.

Милейко В.Е.

Даты

2002-07-10Публикация

1997-09-30Подача