СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ HELICOBACTER PYLORI ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОБУСЛОВЛЕННОЙ ИМИ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 C12N7/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в гастроэнтерологии для выявления Helicobacter pylori в биоптатах для лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний.

Известен способ постановки уреазного теста для выявления Helicobacter pylori в биоптатах при диагностике вызываемых ими заболеваний (Hazell S. Borody T. Zal A. Lee A. //. Compylobacter pyloridis gastritis I Detection of Urease as a. marler of bacterial colonization and gastritis // Amer. J. Zastroeutorol. 1987, v. 82, N 4, p. 292 296). При этом перед постановкой уреазного теста для снижения вероятности неспецифических ложноположительных результатов, обусловленных другими микроорганизмами, биоптаты предварительно обрабатывали азидом натрия. Тест-система включала: 0,05 мл 0,01 М фосфатного буфера, содержащего 2% мочевины; 0,05% фенолового красного и 0,02% азида натрия. Результаты учитывали через 18 ч, чувствительность и специфичность составляли 91% и 100% соответственно.

Вышеуказанное применение азида натрия повышало в известной степени специфичность уреазного теста, но снижало его чувствительность, поскольку при этом не исключалась вероятность бактерицидного действия азида натрия на обнаруживаемые Helicobacter pylori (HP). Кроме того, время тестирования составляло 18 ч.

Цель изобретения сокращение времени тестирования и повышение чувствительности уразного теста при выявлении HP в биоптатах.

Эта цель достигается благодаря внесению в тест-систему 0,05 мл пиобактериофага и 0,05 мл клебсиеллезного бактериофага.

Способ постановки уреазного теста заключается в том, что в стерильную пробирку вносят 0,3 мл забуференного изотонического раствора хлорида натрия, по 0,05 мл пил- и клебсиеллезного бактериофага (НПО "Иммунопрепарат, г. Уфа). Затем погружают исследуемый на наличие H. pylori биоптат, извлеченный в процессе фиброгастроскопии, и индикаторный диск с мочевиной (СИБ, г. Горький). Пробирка с исследуемым материалом закрывается, при 37^oC инкубируется в течение 2 ч. По истечении указанного срока при положительном результате на наличие H. pylori наблюдается окрашивание раствора в малиновый цвет, при отрицательном светло-зеленый (исходный). Преимуществом предложенного способа является повышение чувствительности до 100% при сохраненном уровне специфичности, а также сокращение времени исследования до 2 ч, т.е. в 9 раз в сравнении с прототипом.

Пиобактериофаг комбинированный жидкий (стафилококковый, стрептококковый, коли, пcевдомонас аеругиноза, протейный) выпускается НПО "Иммунопрепарат" (г. Уфа) и предназначен для лечения и профилактики различных форм гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, вызванных перечисленными выше возбудителями, путем перорального или местного применения. Выпускается во флаконах по 20 и 100 мл, хранится в течение года при +4^oC в сухом темном месте.

Бактериофаг клебсиеллезный поливалентный очищенный жидкий выпускается НПО "Иммунопрепарат" (г. Уфа). Предназначен для лечения озены, риносклеромы, гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, вызываемых клебсиеллами, путем перорального или местного применения. Выпускается в ампулах по 5 мл или 10 мл, во флаконах по 20 мл. Срок годности при +4^oC 1 год.

При бактериальном обсеменении биоптатов обработка последних указанными бактериофагами исключает вероятность ложноположительных результатов в процессе индикации H. pylori обусловленными бактериями родов Proteus, Klebsiedda.

Индикацию HP в биоптатах осуществляли при использовании диска с мочевиной систем индикаторных бумажных (СИБ, г. Горький), применяемых для идентификации вибрионов. СИБ представляют собой диски хроматографической бумаги, содержащие определенное количество мочевины в сочетании с индикатором, стабилизированные пленкообразующим полимером поливиниловым спиртом для дифференцировки холерных вибрионов от других микроорганизмов по уреазной активности. Срок хранения при 20±5^oC 2 года.

Пробы биопсийного материала от 20 больных, извлеченные в процессе фиброгастроскопии, исследовали на наличие X. pylori по уреазной активности последних. Полученные данные верифицировали гистологически путем визуального обнаружения HP в биоптатах после окраски по Гимзе и серологически при использовании набора "Roshe" (Швейцария). Результаты приведены в табл. 1.

Таким образом установлено, что в 5 случаях уреазный тест давал ложноположительные результаты.

Высев проб исследуемого материала на питательные среды показал, что в 5 случаях ложноположительный результат уреазного теста был связан с наличием в биоптатах Proteus (3) и Klebsiella (2), обладающих уреазной активностью.

В 20 пробирок с изотоническим раствором хлорида натрия вносили по 0,05 мл пиобактериофага и клебселлезного бактериофага (до светло-зеленого окрашивания), погружали в биоптаты, извлеченные в процессе фиброгастроскопии 20 больных, и помещали по 1 диску с мочевиной. Инкубировали 2 ч при 37^oC.

Результаты отражены в табл. 2.

Проведенные исследования свидетельствуют, что предложенный способ постановки уреазного теста для диагностики заболеваний, вызываемых H. pylori, при использовании бактериофагов является эффективным и имеет ряд преимуществ в сравнении с прототипом: 100% чувствительность, сокращение экспозиции до 2 часов (в 9 раз).

Применение способа делает возможной диагностику гастродуоденальной патологии человека в условиях клинико-бактериологической лаборатории лечебно-профилактических учреждений.

Пример 1.

В клинику поступил больной В. в возрасте 13 лет с жалобами на боли в эпигастрии. В процессе фиброгастроскопии в антральном отделе желудка была обнаружена "полная" эрозия, взят биопсийный материал. После обработки биоптата по описанному выше способу и инкубации в течение 2 ч в термостате при 37^oC выявили малиновое окрашивание раствора, на основании чего был сделан вывод о наличии HP в материале, а следовательно, лабораторно подтвердили диагноз - пилорический хеликобактериоз и была начала соответствующая этиотропная терапия заболевания. Биопсийный материал исследовали гистологически, а сыворотку больного иммуноферментным методом, по результатам которых диагноз также подтвердился, но в более поздние сроки.

Пример 2.

В клинику на дообследование поступил подросток Б в возрасте 14 лет по поводу болей в эпигастрии. При фиброгастроскопии выявлен субатрофический с дуодено-гастральным рефлексом IV ст. и взят материал для исследования. В процессе тестирования биоптата по описанному выше способу не выявлено изменение окраски индикатора, был сделан вывод об отсутствии HP, что позднее подтвердилось гистологически и серологически.

Использование: в медицинской микробиологии, а именно в гастроэнтерологии для выявления Helicobacter pylori в биоптатах для лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний. Сущность изобретения: в стерильную пробирку вносят забуференный изотонический раствор хлорида натрия, пио- и клебсиеллезный бактериофаги, погружают исследуемый на наличие H pylorim биопат, извлеченный в процессе фиброгастроскопии, индикаторный диск с мочевиной (СИБ). При окрашивании раствора в малиновый цвет определяют наличие H. pylory, при сохранении светло-зеленого - его отсутствие. 2 табл.

Способ выявления Helicobacter pylori для диагностики обусловленной ими гастродуоденальной патологии, включающий отбор биоптата, обработку его бактерицидом, внесение в тест-систему, состоящую из буфера, мочевины, бактерицида и индикатора фенолового красного, с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что в качестве бактерицида используют пио- и клебсиеллезный бактериофаги, применяют индикатор, стабилизированный поливиниловым спиртом, а о наличии Helicobacter pylori судят по малиновому окрашиванию.