Изобретение относится к биотехнологии и касается производства и применения биопрепаратов, в частности иммуномодуляторов, для коррекции нарушений иммунной системы и используемых для лечения и профилактики инфекционных, инвазионных и незаразных болезней млекопитающих, птиц и рептилий.
Каждому живому существу (будь то млекопитающее, птица или рептилия) от рождения дан прекрасный защитник иммунная система. От ее состояния зависят качественные показатели каждого вида, его устойчивость к заболеваниям и выживаемость.
В последнее время доказана прямая связь многих инфекционных и неинфекционных заболеваний с нарушением иммунной системы. В связи с этим для лечения все чаще применяют иммуномодуляторы, цель которых восстановить собственные защитные силы организма.
Известны и хорошо себя зарекомендовали в клинической практике препараты нового поколения, полученные на основе биотехнологии: природные и рекомбинантные интерфероны, интерлейкины, фосфолипиды и т.д. ("Современное состояние и перспективы развития зарубежного рынка иммуномодуляторов" (обзор). НПО "Медбиоэкономика", НИИТЭХИМ, 1990). Однако экзогенное применение этих дорогостоящих препаратов требует больших доз, поскольку они быстро выводятся из организма, что может привести к аллергическим реакциям.
Интенсивное развитие биоэлементорганической химии создало предпосылки для синтеза новых лекарственных препаратов на основе кремний- и германийорганических соединений, которые выгодно отличаются по своим токсикологическим характеристикам (Игнатенко М.А. "Противоопухолевая активность кремний- и германийорганических соединений" (обзор). Хим. фарм. журнал, 1987, N 4, с. 402-408).
Повышенный интерес к синтезу и исследованию биологической активности германийорганических соединений связан с их широким спектром действия. Они обладают противоопухолевой активностью, оказывают благоприятное действие при сердечно-сосудистых болезнях, хронических респираторных заболеваниях, психоневрологических расстройствах, нарушении обмена веществ, некоторых формах аллергии, болезнях почек, печени, органов пищеварения, гипертонии и катаракте.
Наиболее близким аналогом является препарат для лечения и профилактики заболеваний позвоночных, включая и человека, на основе германийорганического соединения формулы (GeCH2CH2COX) 2O3, где X= OH, NH2 или O-алкил. Механизм действия препарата основан на его способности стимулировать образование в живом организме иммуномодулятора гамма-интерферона важнейшего фактора неспецифической резистентности организма (Патент США N 4279892, A 61 K 39/00, 1981). Однако технология синтеза соединения связана с большими трудностями и затратами.
Технической задачей изобретения является расширение спектра действия иммуномодулятора на основе германийорганического соединения.
Технический результат изобретения заключается в скрининге нетоксичного иммуномодулятора, способного подавлять размножение ряда вирусов (герпес, арбовирусы), проявляющего противостафилакокковую, противоопухолевую, радиопротекторную и антигельминтную активности, а также способного восстанавливать и улучшать качество волосяного покрова у животных.
Сущность изобретения: препарат "ДИНА" для лечения и профилактики млекопитающих, птиц и рептилий относится к группе иммунокорректоров синтетического происхождения на основе германийорганического соединения, а именно представляет собой германийорганическое производное пиколиновой кислоты следующей формулы C42H24N6O21Ge3.
Препарат "ДИНА" способен корректировать иммунную систему до нормального состояния на всех ее звеньях: оказывает иммуномодулирующее действие на В- и Т-системы иммунитета, стимулирует иммунореактивность к специфическим антигенам, функциональную активность макрофагов, вызывает выработку альфа-, бета- и гамма-интерферонов и лимфокинов.
Препарат "ДИНА" усиливает защитные механизмы организма млекопитающих, птиц и рептилий и способствует лечению и профилактике ряда инфекционных и вирусных заболеваний, например, сальмонеллез, колибактериоз, пироплазмоз, отит, пневмония, аденовироз, инфекционный гепатит, вирусный энтерит, панлейкопения, вирусный ринотрахеит, чума плотоядных и т.д. кожных заболеваний различной этиологии, глазных болезней, например, блефарит, конъюктевит, кератит, инвазионных болезней.
Кроме того, препарат "ДИНА" может быть с успехом использован в качестве репаранта кожных и тканевых повреждений, а также как ускоритель восстановления волосяного покрова на местах постинфекционных и метаболических аллопеций.
Препарат "ДИНА" усиливает также действие антибиотиков на патогенные микроорганизмы, проявляя синергизм действия, что позволяет снизить их дозу в 2 раза, а также в большинстве случаев исключить использование гормональных препаратов.
Препарат "ДИНА" совместим с вакцинами, исключает поствакциональные осложнения и обеспечивает стойкий иммунитет в течение года. Применение препарата "ДИНА" для молодняка животных (2-3 мес) позволяет преодолеть "иммунологическую дыру" без вакцинации в течение 3-6 мес.
Было также выявлено (по результатам капрологических исследований), что у животных с нарушением функций органов желудочно-кишечного тракта и органов внутренней секреции отмечалось заметное улучшение их функционирования.
Кроме того, препарат "ДИНА" позволяет синхронизировать половой цикл и способствует сохранению плода.
Для домашних и промышленных животных препарат "ДИНА" также является прекрасным антимутагенным и седативным препаратом.
Препарат "ДИНА" не токсичен: ЛД50 составляет свыше 2000мг/кг. Быстро выводится из организма, распадаясь на углекислый газ, воду и нетоксичные вещества.
Препарат "ДИНА" водорастворимый, белый порошок с максимальной растворимостью до концентрации 0,5%
Основной способ введения препарата "ДИНА" подкожная инъекция. Продолжительность терапевтического курса определяется тяжестью и запущенностью заболевания. В среднем продолжительность курса составляет 6-10 инъекций по 0,5 мл подкожно через 8-10 ч. В качестве профилактической меры, при угрозе инфекции однократное введение 1 мл препарата. Препарат можно вводить также внутримышечно или перорально.
При лечении глазных болезней применяют 0,15% раствор по 1 капле 2 раза в день.
При кожных заболеваниях и для улучшения волосяного покрова рекомендуется делать 3 инъекции по 0,5 мл подкожно с интервалом 1 нед. Улучшение волосяного покрова наступает через 3-4 нед.
Противопоказаний к применению не установлено.
Препарат "ДИНА" получен на основе доступного сырья: замещенных пиридинов и хлор-(алкокси) германов в три стадии при температуре 80-90oC. Продукт выделяют фильтрованием и сушкой под вакуумом.
Пример 1. Препарат "ДИНА" используется в ветеринарной практике при терапии и профилактике некоторых инфекционных, инвазионных и незаразных болезней собак и кошек.
При лечении инфекционных вирусных заболеваний: чума плотоядных (катаральная, кожная, кишечная формы), парвовирусный энтерит, инфекционный гепатит и другие заболеваний собак (более 1500 животных разных пород и возрастов) препарат "ДИНА" использовали в комплексной симптоматической терапии от 3 до 6 доз на курс лечения. Эффективность составила 80-87% (процент излечения). При лечении нервной формы чумы (82 собаки) эффективность составляет 50-60%
При лечении панлейкопении и вирусного ринотрахеита кошек (около 300 животных) эффективность составила 90% и 83% соответственно.
При лечении кожных болезней (демодекоз, микроспория, трихофития, экземы, дерматиты, аллопеции различной этиологии) препарат применяли более чем на 1000 животных (кошек и собак). Эффективность в этом случае составила 90-98%
Использование препарата перед прививками существенно снижало количество поствакцинальных осложнений и обеспечивало более надежный иммунитет.
Препарат обеспечивал достаточно надежную иммунную защиту животных от инфекционных болезней и без использования вакцин. Так, из группы не привитых собак (15 животных), которым по определенной схеме с трехмесячного возраста до года вводили препарат, за период наблюдения (1 год) заболело всего 3 животных. В контрольной группе за этот период заболеваемость составила 35-40%
Пример 2. Препарат "ДИНА" применяют при различных кожных поражениях у кошек: дерматит, экзема, аллопеции и др. В опыте использованы кошки различных пород и возрастных групп. Выявленные поражения были незаразной и инфекционной патологии. Препарат оказал стабильный высокий результат при этих заболеваниях, а также при нарушении обменных процессов в организме животного.
Курс лечения составлял 2-3 инъекции препарата. После проведенного лечения положительный результат в 85-87% случаев наблюдался на 17-24 день. Места поражения покрывались шерстяным покровом и улучшалось общее состояние животного.
Пример 3. Препарат "ДИНА" применяют на различных видах животных (телята, собаки, кошки) для лечения таких глазных заболеваний, как поверхностно-гнойный кератит, фликтенулезный кератит, катаральный конъюктивит, блефарит.
Препарат вводят подкожно и в виде глазных капель. Улучшение наступает обычно на 3-4 день с начала введения; процент излечения составляет, в среднем, 90%
Пример 4. Препарат "ДИНА" используют для лечения рептилий черепах, ящериц, змей.
Препарат повышает естественную резистентность организма рептилий, обладает противовирусным и антимикробным действием.
Препарат "ДИНА" использован для лечения следующих заболеваний: пневмония, парвовирусный энтерит, кишечные инфекции, стафилококковые инфекции, дерматиты различной этиологии, стоматиты и гнойные абсцессы.
Препарат вводят рептилиям подкожно или перорально по 0,2 мл (3 капли) 1 раз в день в течение 3-5 дней.
При угрозе стрессовых ситуаций (при перевозке, смене условий содержания и др.) препарат дают по 3 капли 1 раз в день.
Для ускорения заживления послеоперационных швов, различных повреждений кожи и при дерматитах делают примочки препаратом 2 раза в день.
Препарат "ДИНА" показал высокий терапевтический эффект при лечении указанных заболеваний рептилий.
Пример 5. Препарат "ДИНА" используют для лечения домашней (куры, утки, гуси и др.) и декоративной (попугаи, кенары и др.) птицы.
Препарат применяют для лечения следующих заболеваний птиц: простудные заболевания, кишечные инфекции, нарушение обмена веществ, нарушение оперения, а также для профилактики заболеваний птицы, в основном молодняка.
Препарат дают перорально: домашней птице по 3 капли, цыплятам и декоративной птице по 1-2 капли 2 раза в день в течение 3-5 дней.
Препарат можно применять для профилактики заболеваний и снижения смертности в случае эпидемии. Для этой цели производят выпойку разбавленным раствором препарата: на 100 цыплят (птенцов) раствор 5 мл препарата в 0,5 л воды.
Использование препарата дает возможность снизить процент падежа молодняка в 1,5-2 раза по сравнению с контролем. Отмечен также большой прирост в весе молодняка, получавшего препарат.
Пример 6. Определение противовирусной активности препарата "ДИНА" в отношении вируса герпеса и цитомегаловируса проводят на диплоидных клетках легкого эмбриона человека (ЛЭЧ).
Клетки ЛЭЧ культивируют в 96-луночных платах в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (посевная доза 4•106 клеток на лунку). На третий день после образования монослоя клетки обрабатывают препаратом "ДИНА" в концентрации от 3 до 50 мкг/мл, инкубируют 1 ч при 37oC в присутствии 5% CO2, после чего препарат удаляют, клетки отмывают раствором Хэнкса и вносят в каждую лунку по 100 мкл 10-кратных разведений либо вируса простого герпеса тип 1 (ВПГ-1), например, штамм SG-16 в исходном титре 105,5-106,0 ТЦД50, либо цитомегаловируса (ЦМВ), штамм AD 169 в исходном титре 108-108,5ТЦД50.
На 4-тые сутки для ВПГ-1 или на 7-11-тые сутки для ЦМВ определяют титр вируса путем титрования по цитопатическому действию (ЦПД50) на монослое клеток ЛЭЧ; контролем служат лунки с инфицированным вирусом, но не обработанными препаратом "ДИНА" клетками ЛЭЧ.
Оптимальные результаты получены при 50 мкг/мл препарата (табл. 1), при этом отмечалось снижение титра ВПГ на 0,3 3,2 lg ТЦД50/0,1мл или ЦМВ на 3,5-3,75lgТЦД50/0,1мл. Таким образом, препарат "ДИНА" способен ингибировать развитие названных вирусов в клетках, подавляя их размножение в 100-8000 раз.
Пример 7. Определение противоопухолевого эффекта препарата "ДИНА" проводят in vitro проводят на модели герпесиндуцированной опухоли на сирийских хомяках весом 100 г, исследуя также интерфероновый статус организма животных.
Препарат "ДИНА" вводят трехкратно по 0,2 мл в концентрации 5 мг/кг веса за 24 ч до введения опухолевых клеток, одновременно с опухолевыми клетками и на 6 сут после инокуляции опухолевых клеток.
Обнаружен противоопухолевый и иммуномодулирующий эффект при опухоли, индуцированной ДНК ВПГ-1 у сирийских хомячков. Кровь, взятая у хомячков после обработки их препаратом "ДИНА" показала высокий титр иммунного интерферона.
Длительность латентного периода возникновения опухолей в опытной группе достигала 37 дней с момента введения опухолевых клеток по сравнению с 12 дней в контроле. Обнаружена разница в размерах опухолей по сравнению с контролем (размер опухолей снижен в 2-3 раза) под влиянием препарата "ДИНА".
Под влиянием препарата "ДИНА" достоверно увеличилась продолжительность жизни хомяков опухоленосителей. Так к 42-ому дню в контроле осталось в живых лишь 25% хомяков, в опытной группе животных гибель к этому сроку не отмечалась. К 71-му дню после введения опухолевых клеток при 100% гибели животных в контроле в опытной выжило 50% животных. У 25% животных опытной группы опухоли не возникали до 113-го дня с момента имплантации опухолей. У 15% животных, получивших препарат "ДИНА", опухоли не развились в течение срока наблюдения (около 1 года) (табл. 2).
Таким образом, препарат "ДИНА" обладает ингибирующей активностью в отношении вирусов групп герпеса как в опытах in vitro, так и на животных. По своей опухолеингибирующей активности он не уступает РНК фага и дрожжевой РНК.
Препарат "ДИНА" может быть рекомендован в комплексной терапии при онкологических заболеваниях, этиологическим фактором которых могут являться вирусы группы герпеса.
Пример 8. Для определения эффективности препарата "ДИНА" при особо опасной инфекции арбовирусов вируса западного энцефаломиелита лошадей (альфавирусная инфекция) беспородным мышам вводят подкожно 10-12 г препарата в объеме 0,1 мл в разовой дозе 50 мкг/кг веса по схеме: за 24 ч, одновременно и через 24 ч после инфицирования 10 ЛД50 вируса. Курсовая доза препарата "ДИНА" составляет 150 мкг/кг веса. Вирус вводят внутримышечно в объеме 0,1 мл. Полученные результаты представлены в табл. 3.
Эффективность препарата "ДИНА" не уступает известному индуктору интерферона ридостину. Препарат "ДИНА" имеет широкий спектр действия, активен при острых и физиологических путях введения, клинически перспективен при химиотерапии нейровирусных инфекций, обусловленных альфавирусами (ЗЭЛ), что особенно важно, так как против инфекций, вызванных ЗЭЛ, вообще отсутствуют средства как специфической профилактики, так и лечения.
Пример 9. Интерферониндуцирующую активность препарата "ДИНА" определяют на мышах линии СВА при пероральном, внутрибрюшинном, внутримышечном и подкожном введениях в оптимальной дозе 0,5 мг/кг. Уровень синтеза интерферона (ИФН) определяют в сыворотке крови через различные промежутки времени после введения препарата "ДИНА" (от 5 до 72 ч). Пик ИФН) отмечается через 48 ч после введения препарата. Наиболее активно синтезируется ИФН при пероральном и подкожном введении. При пероральном применении препарата "ДИНА" пик активности ИФН сдвигается к 24 ч.
Исследование степени участия иммуноцитов в продукции ИФН позволило установить, что тимоциты наименее активно синтезируют ИФН при всех путях введения. При пероральном и внутрибрюшинном способе применения синтезируют ИФН клетки костного мозга и спленоциты, при внутримышечном спленоциты, при подкожном клетки костного мозга и тимоциты.
Пример 10. Определение противовирусной активности препарата "ДИНА" в отношении буньявирусных инфекций: лихорадки долины Рифт (ЛДР), лихорадки Иссык-Куль и Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) проводят на беспородных белых мышах весом 15-20 г.
Препарат "ДИНА" обладает выраженным защитным эффектом в отношении экспериментальных инфекций белых мышей ЛДР (80%), КГЛ (70%) и лихорадки Иссык-Куль (85%).
Препарат активен при пероральном, подкожном и внутримышечном путях введения в концентрации 50 мкг/мышь. Наибольшая эффективность наблюдается при профилактической или превентивной схемах применения.
Пример 11. Исследование препарата "ДИНА" на устойчивость к стафилококковой инфекции проводят на мышах линии СВА при подкожном введении в диапазоне доз от 0,1 до 10 мкг на мышь. После введения препарата "ДИНА" животных заражают 1,25•109 микробных клеток Staph. aureus штамм Wood 46 и определяют выживаемость животных в процентах по отношению к выживаемости мышей в контрольной группе, которым препарат не вводят. Результаты представлены в табл. 4.
Результаты опыта свидетельствуют о том, что препарат "ДИНА" в диапазоне доз от 0,1 до 10 мкг на мышь вызывают повышение неспецифической резистентности к стафилококку. Стимулирующий эффект наиболее выражен при применении наименьшей из испытанных доз 0,1 мкг на мышь (индекс стимуляции 2,56).
Пример 12. Препарат "ДИНА" оказывает влияние на функциональную активность макрофагов по многим показателям: хемотаксису, степени выраженности лизосомного аппарата, секреции белковых продуктов, фагоцитарной функции.
Проведенные в динамике экспериментальные исследования на мышах линий СВА и C57B1/6 показывают, что это усиление наблюдается уже через 15 мин после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 20 мкг и сохраняется от 1 до 3 сут.
Экстренный характер воздействия препарата "ДИНА" позволяет использовать его в тех случаях, когда необходимо срочно усилить неспецифическое звено защиты организма, например, при некоторых вирусных и других инфекционных заболеваниях.
Пример 13. Препарат "ДИНА" применяют для лечения инфекционных и вирусных заболеваний лис, норок и песцов, в основном перорально, в тяжелых случаях, в виде инъекций. Курс лечения 3-6 доз 0,15%-го раствора. Для профилактики достаточно 1 дозы препарата.
Применение препарата "ДИНА" повышает жизнестойкость молодняка и улучшает качество меха.
Пример 14. Препарат "ДИНА" применяют для лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней крупного рогатого скота.
Испытание препарата проводят на группах животных, подобранных по типу аналогов (с постановкой контроля).
В качестве базы для сравнения принимают группу животных (40 телят), где препарат не используют (контрольная группа).
Препарат "ДИНА" испытывают с лечебной (20 телят) и профилактической целью (60 телят) на крупном рогатом скоте (возрастная группа 5 дней 2 мес). У больных животных наблюдались клинические признаки, характерные для респираторных и желудочно-кишечных заболеваний.
Перед применением препарата проводят клинический осмотр животных по схеме: температура, пульс, дыхание, состояние отдельных систем. Клиническое обследование по полной схеме проводят один раз в пять дней на протяжении всего опыта. Продолжительность наблюдений за опытной и контрольной группами составляют два месяца.
При определении терапевтической эффективности препарата "ДИНА" проводят оценку продолжительности клинических симптомов (в сравнении с контрольной группой), количества требуемых обработок, скорости выздоровления больных животных.
Терапевтическая эффективность препарата "ДИНА" составили у животных с клинической симптоматикой, характерной для смешанных респираторных инфекций, 74% Лечебный курс 5-6 инъекций.
У животных с клинической симптоматикой, характерной для желудочно-кишечных инфекций (колибактериоз, сальмонеллез), 84%
Терапевтический курс зависит от тяжести течения и формы проявления болезни и в среднем равен 5-6 дням.
Препарат "ДИНА" рекомендован для профилактики и терапии респираторных и желудочно-кишечных заболеваний телят разных возрастных групп в комплексе с другими специфическими и симптоматическими средствами. Его применение приводит к выздоровлению животных в среднем на 5 сут, снижает использование антибиотиков на 50%
В группе животных, получавших профилактическую дозу препарата "ДИНА" (0,5 мл, двукратно) и в течение двух месяцев (срок наблюдений), заболеваний не отмечено. Состояние животных хорошее.
Использование: биотехнология, иммуномодулятор, препарат для лечения и профилактики заболеваний млекопитающих, птиц и рептилий. Сущность изобретения: препарат "ДИНА" для лечения и профилактики заболеваний всех видов млекопитающих, птиц и рептилий представляет собой германийорганическое производное пиколиновой кислоты формулы C42H24N6O21Ge3. Фармакологическое действие препарата включает в себя широкий спектр активностей: иммуномодуляция (в качестве основного), антивирусная, противоопухолевая, радиопротективная и антимикробная. Для домашних и промышленных животных "ДИНА" является также прекрасным антимутагенным и седативным препаратом. Препарат может быть использован в качестве репаранта кожных и тканевых повреждений, а также как ускоритель восстановления волосяного покрова на местах постинфекционных и метаболических аллопеций. 4 табл.
| SU, патент, 4279892, A 61 K 39/00, 1981. |
