ПРЕПАРАТ "МИЛОН" ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/00 A61K39/39 A61K31/28 C07F7/30 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства и применения биопрепаратов, в частности, иммуномодуляторов, для коррекции нарушений иммунной системы и используемых для лечения и профилактики инфекционных и инвазионных болезней млекопитающих.

В настоящее время доказана прямая связь многих инфекционных и неинфекционных заболеваний с нарушением иммунной системы. В связи с этим, для лечения все чаще применяют иммуномодуляторы, цель которых - восстановить собственные защитные силы организма. Известны и хорошо себя зарекомендовали в клинической практике препараты нового поколения, полученные на основе биотехнологии: природные и рекомбинантные интерфероны, интерлейкины, фосфолипиды и т. д. ["Современное состояние и перспективы развития зарубежного рынка иммуномодуляторов", обзор НПО "Медбиоэкономика", НИИТЭХИМ, 1990]. Однако, применение этих дорогостоящих препаратов требует больших доз, что часто приводит к аллергизации организма. За последние годы возрос интерес к химии германийорганических соединений в связи с тем, что было обнаружено повышенное содержание элемента германия в таких биологически активных растениях, как чеснок, корень женьшеня и некоторых других. Именно этим объясняется широкий спектр лечебных свойств указанных растений. Соединения германия выгодно отличаются от многих синтетических иммуномодуляторов по своим токсикологическим характеристикам [Игнатенко М. А. "Противоопухолевая активность кремний- и германийорганических соединений", обзор. Хим. фарм. ж., 1987, N 4, с. 402 - 408].

Повышенный интерес к синтезу и исследованию биологической активности германийорганических соединений связан с их широким спектром действия. Они обладают противоопухолевой, антивирусной, антибактериальной активностями, оказывают благоприятное действие при некоторых психоневрологических расстройствах, нарушении обмена веществ, некоторых формах аллергии, болезнях почек, печени, органов пищеварения и глазных заболеваниях. Наиболее близким аналогом является препарат для лечения и профилактики заболеваний позвоночных, включая и человека, на основе германийорганического "соединения формулы (GeCH₂CH₂COX)₂O₃, где X = OH, NH₂ или О - алкил. Механизм действия препарата основан на его способности корректировать иммунную систему за счет выработки в организме интерферона - важнейшего фактора неспецифической резистентности организма [Патент США N 4279892, A 61 K 39/00, 1981]. Однако технология синтеза соединения связана с большими трудностями и затратами. Технической задачей изобретения является расширение спектра действия иммуномодулятора на основе германийорганического соединения. Технический результат изобретения заключается в скрининге нетоксичного иммуномодулятора, способного подавлять размножение ряда вирусов (герпес, вич, арбовирусы), вирус ринотрахеита, гепатита, проявляющего противотуберкулезную и антигельминтную активности.

Сущность изобретения: препарат "Милон" для лечения и профилактики заболеваний млекопитающих относится к группе иммунокорректоров синтетического происхождения на основе германийорганического соединения, а именно, представляет собой германийрганическое производное пиридиндиола следующей формулы: C₁₅H₂₇N₃O₆Ge.

Препарат "Милон" способен корректировать иммунную систему на уровне макрофагального и фагоцитарного звена. Препарат "Милон" усиливает защитные механизмы организма млекопитающих и способствует лечению и профилактике ряда инфекционных заболеваний, например, герпеса, ВИЧ, вирусного ринотрахеита, гепатита, туберкулеза, арбовирусных инфекций (разновидности тропической лихорадки) и др. Препарат "Милон" не токсичен: ЛД₅₀ составляет свыше 2500 мг/кг, быстро выводится из организма, распадаясь на углекислый газ, воду и нетоксичные вещества.

Препарат "Милон" - водорастворимый, кремового цвета порошок. Для лечения применяются 0,3% и 0,015% водные растворы. Основной способ введения препарата "Милон" - пероральный или подкожный. Продолжительность терапевтического курса определяется тяжестью и запущенностью заболевания, в среднем, продолжительность составляет 5-10 инъекций по 0,3 мл подкожно 1 раз в день, или 3 капли в 1 чайную ложку воды при пероральном приеме.

Противопоказаний к применению не установлено.

Препарат "Милон" получен на основе доступного отечественного сырья: замещенных пиридингерманов и этаноламинов в одну стадию, при температуре 50 - 100^oC. Продукт выделяется фильтрованием и сушкой под вакуумом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Препарат "Милон" используется в ветеринарной практике при терапии некоторых инфекционных болезней собак и кошек.

При лечении вирусных заболеваний: гепатит и ринотрахеит собак (более 300 животных разных пород и возрастов), препарат "Милон" использовался в комплексной симптоматической терапии от 3 до 10 доз на курс лечения. Эффективность составила 85 - 87% (процент излечения) при инфекционном гепатите и 88 - 92% при вирусном ринотрахеите. При лечении кошек (более 250 особей) от вирусного ринотрахеита эффективность составила 90 - 95%. При лечении герпесных заболеваний животных эффективность составляет 80 - 83% (62 собаки и 23 кошки) при курсе - 10 инъекций 1 раз в день по 0,3 мл. При герпесных инфекциях глаз эффективность 95% излечения достигается при закапывании в глаза 0,015% водного раствора "Милона" 2 раза в день по 1 капле.

Пример 2. Определение противовирусной активности препарата "Милон" в отношении вируса герпеса проводят на диплоидных клетках легкого эмбриона человека (ЛЭЧ). Указанные клетки культивируют в 96-луночных платах в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (посевная доза 4х10⁶ клеток на лунку). На 3-й день, после образования монослоя, клетки обрабатывают "Милоном" в конц. от 10 до 100 мкг/ мл, инкубируют 1 час при 37^oC в присутствии 5% CO₃, после чего препарат удаляют, клетки отмывают раствором Хэнкса и вносят в каждую лунку по 100 мкл 10-кратных разведении вируса герпеса тип 1 (ВПГ-1, штамм S_c-16, ЧСФР, исходный титр 10^5,5-10^6,0 ТЦД₅₀). На 4-е сутки для ВПГ-1 определяют титр вируса путем титрования по ЦПД на монослое клеток ЛЭЧ; контролем служат лунки с инфицированным вирусом, но не обработанные "Милоном", клетками ЛЭЧ.

Оптимальные результаты получены при 50 мкг/мл "Милоном" (таб. 1), при этом отмечалось снижение титра ВПГ на 3,0 - 3,2 ТЦД₅₀/0,1 мл. Следовательно, "Милон" способен ингибировать развитие герпесных вирусов в клетках.

Таким образом, "Милон" обладает высокой противовирусной активностью в отношении простого герпеса, подавляя его размножение в 100 - 8000 раз.

Пример 3. Противовирусная активность препарата "Милон" в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ ) в моделях in vitro.

В опытах используют суспензионные человеческие лимфобластные Т-клетки Н9, ВИЧ 2 штамма ШВ и RF.

Линию перевиваемых Т-лимфобластоидных клеток человека МТ-4 и персистентно зараженную ВИЧ клеточную линию H₉/III В культивируют в виде суспензии в среде PPMI 1640 с 15% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 300 мкг/мл глютамина, 100 мкг/мл гентамицина, 10 мл НЕРЕС 0,5 - 1,0 • 10^6,0 кл/мл. Для инфицирования клеток МТ-4 используют концентрат культуральной жидкости клеток Н9/III В, полученный при центрифугировании через градиент 20% сахарозы при 24000 об/мин, в дозе 300 ТДД_50/мл. В часть проб клеток МТ-4 не менее чем за 2 часа до заражения добавляют разные концентрации "Милона". После этого клетки инкубируют 6-9 суток при 37^oC в атмосфере с 5% CO₂ и 98% влажности, отделяют клетки центрифугированием и в камере Горяева определяют общее количество клеток, их жизнеспособность с использованием красителя трипанового синего; наличие на клеточной поверхности вирусоспецифического антигена ВИЧ определяют по свечению после обработки клеток люминесцирующей сыворотки больного СПИД, содержащей антитела к ВИЧ. Выявлено что обработка клеток "Милоном" достоверно повышала процент клеток, несущих антиген ВИЧ; наиболее эффективной оказалась доза 100 мкг/мл (таб. 2).

Из таблицы 2 видно, что препарат "Милон" обладает выраженной противовирусной активностью по отношению к возбудителю СПИДа вирусу иммунодефицита человека при оптимальной концентрации 100 мкг/мл и приводит к снижению процента клеток с антигеном до 12% против 44% в контроле и к сохранению живых клеток до 92% против 40% в контроле на 6-й день опыта. Соответственные данные на 9-й день равны 76% против 30% и 20% против 56%.

Таким образом, препарат "Милон" в концентрации 50-100 мкг/мл защищает от цитопатического действия от 63 до 92% процентов клеток и в 2,5 - 3 раза уменьшает процент клеток, несущих на поверхности вирусный антиген.

Пример 4. Определение антивирусной активности препарата "Милон" в отношении буньянвирусных инфекций: лихорадки долины РИФТ (ЛДР) и представителями антигенной группы калифорнийского энцефалита вирусов зайца беляка (штамм Таймыр) и вируса Инко (штамм Удмуртия 20547).

Опыты проводили на беспородных белых мышах весом 15 - 20 г. Исследования показали, что "Милон", в дозе 50 мкг/мл при пероральном введении, обладает выраженным защитным эффектом в отношении ЛДР на 90%, против вируса ИНКО - на 60% и на 90% - против вируса зайца беляка. Наибольшая эффективность отмечена при превентивном и профилактическом применении.

Пример 5. Исследование антивирусной активности препарата "Милона" в отношении вируса гепатита A (ВГА).

Модель: вирус гепатита A (ВГА) штамм HAS-15, культивируемый в перевиваемых клетках почки эмбриона макаки-резус FRhk-4, BTA (энтеровирус 72) - своеобразный представитель семейства Picornavizidal. В отличие от других пикорновирусов, для ВГА характерен длительный цикл репродукции, отсутствие цитопатогенного действия, преимущественно внутриклеточная локализация вирусного потомства. ВГА более чем другие пикорновирусы устойчив к инактивирующим агентам, стабилен при низких pH (до 2,0), при комнатной температуре сохраняет инфекционность в течении 1 месяца. Инакувация идет только при 100^oC (5 мин) или при 60^oC (1 час). Инактивируется формамином при 37^oC, 3 дня.

Эксперимент. Монослой клеток FRhk-4 (среда роста: среда Игла-МЕМ с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов, 10% фетальной сыворотки) инокулировали вирусом ВГА (рабочая доза 10-3); 4 контрольных флакона инокулировали при 37^oC 24 сутки с еженедельной сменой среды поддержания (Игла-2МЕМ, 1% фетальной сыворотки). Содержание ВГА определяли в клеточных лизатах на 7-е и 24-е сутки после инфицирования.

Исследование проводилось по следующей схеме:
а) определяли влияние препарата "Милон" на антигенность ВГА иммуноферментным методом (ИФМ) при концентрациях препарата 10 и 100 мкг/мл, при этом было установлено, что препарат "Милон" не нарушает антигенности ВГА;
б) исследовалась продукция ВГА в культуре клеток FRhk-4, предварительно обработанной препаратом "Милон" в концентрациях 2,5 и 25 мкг/на флакон, при этом было обнаружено, что препарат "Милон" эффективно подавляет ВГА в культуре клеток FRhk-4 (~76-82%) уже на ранних этапах инфекции;
в) определялась продукция ВГА при заражении культуры клеток FRhk-4 вирусом, предварительно обработанным препаратом "Милон" в дозах 1 и 10 мкг/РД вируса, при этом наблюдалось значительное подавление репродукции ВГА на ранних этапах инфекции (до 80%);
г) исследовали ВГА при одновременном инокулировании культуры клеток FRhk-4 вирусом и препаратом "Милон", при этом наблюдали максимальный эффект (86-93%) подавления репродукции вируса.

Из представленных результатов видно, что препарат "Милон" может быть использован для профилактики и лечения гепатитов.

Пример 6. Действие препарата "Милон" на функциональное состояние макрофагов.

Изучали в динамике влияние препарата "Милон" на хемотоксическую, фагоцитарную и НСТ-активности, на состояние лизосомного аппарата и секрецию белковых продуктов в макрофагах перитонеального экссудата.

Препарат вводили мышам линий СВА и C₅₇Bl₆ внутрибрюшинно, в дозе 25 мкг на мышь.

Хемотоксическую активность препарата "Милон" оценивали in vivo по количеству прилипающих клеток в перитонеальной полости мышей в разные сроки после его введения. Наблюдали усиление притока макрофагов в брюшную полость с максимумом на 3-и сутки. Наиболее выраженное увеличение этого показателя наблюдалось у мышей с исходно низким их содержанием у интактных животных (СВА).

Отмечено усиление процессов окислительного метаболизма (НСТ-тест) у мышей линии СВА под влиянием препарата "Милон" через 1 час после его введения. У мышей линии C₅₇Bl₆ изменений этого показателя функциональной активности макрофагов не выявлено.

Исследование влияния препарата "Милон" на состояние лизосомного аппарата в АО-тесте показало, что степень выраженности лизосом усиливается уже через 15 минут после его введения (на мышах линии СВА) и остается высоким через 1 час и через 1 сутки (сроки наблюдения).

"Милон" приводил к усилению секреции белковых продуктов (по интенсивности синтеза белка) уже через 15 минут после его введения мышам линии СВА. Высокий уровень этого показателя функциональной активности макрофагов - до первых суток включительно. На мышах линии C₅₇Bl₆ усиленная секреция белковых продуктов наблюдалась через 1 час после введения препарата.

Исследование одной из стадий фагоцитарной активности макрофагов, а именно, захвата брюшнотифозной вакцины - ¹⁴C in vitro, показало увеличение ее при введении препарата за 1 час и 1 сутки у обеих линий мышей.

Анализ приведенных выше данных позволяет сделать вывод, что препарат "Милон" обладает свойством экстренно усиливать функциональную активность макрофагов по многим показателям: хемотаксис, окислительный метаболизм, степень выраженности лизосомного аппарата, секрецию белковых продуктов, фагоцитарную функцию. Это усиление наблюдается уже через 15 минут после введения препарата и сохраняется от 1 до 3 суток.

Эти результаты могут быть критерием того, что изучаемый препарат является иммуномодулятором. Учитывая экстренный характер воздействия препарата, можно рекомендовать его в тех случаях, когда необходимо экстренно усилить неспецифическое звено защиты организма, например, при некоторых вирусных и других инфекционных заболеваниях, а также в случае вирусоносительства.

Пример 7. Исследование препарата "Милон" при лечении псевдотуберкулезной инфекции.

В опытах использовалась модель инфекции Y. pseudotuberculesis штамма 3260pM82⁺p45⁺ в концентрации 10⁴ и 10⁵ кл/мл на мышах линии СВА. Статистическая обработка результатов была проведена с помощью критерия χ² , в экспериментах было использовано 120 мышей. Дозы препарата "Милон" были в интервале от 10 до 500 мкг/мышь. Использовались следующие схемы лечения:
1) профилактическое 3-кратное внутрибрюшинное введение препарата за 3 суток до заражения в дозах 10, 100 и 500 мкг/мышь;
2) однократное внутрибрюшинное введение мышам СВА препарата "Милон" в тех же концентрациях в течении 3-х суток, через 24 часа после заражения.

Было установлено, что препарат "Милон" оказывает профилактическое действие при данной инфекции в дозе 100 мкг/мышь, т. к. сохранялось 55-60% мышей при 100% гибели в контроле. Проведение лечения зараженных мышей препаратом "Милон" в той же дозе при внутрибрюшинном введении в течение 3-х суток повышает процент выживаемости мышей до 72-75% при 100% гибели в контроле.

Пример 8. Определение антигельминтной активности препарата "Милон".

Исследования проводились на белых беспородных мышах весом 20 г путем однократного перорального введения препарата в дозах 10 до 500 мг/кг. На каждую дозу использовали 5 животных. В результате проведенных опытов было установлено, что препарат "Милон" в дозе 300 мг/кг эффективно излечивает от ниппостронгилесов (процент излечения 75-80%).

Препарат предназначен для коррекции нарушений иммунной системы и лечения и профилактики инфекционных и инвазионных болезней всех видов млекопитающих. Препарат "Милон" представляет собой германийорганическое производное пиридиндиола состава C₁₅H₂₇N₃O₆Ge. Фармакологическое действие препарата включает в себя широкий спектр активностей: иммуномодуляцию (в качестве основного), антивирусную, антигельминтную, антибактериальную. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Препарат для лечения и профилактики заболеваний млекопитающих на основе германийорганического соединения, отличающийся тем, что из германийорганических соединений он содержит германийорганическое производное пиридиндиола формулы C₁₅H₂₇N₃O₆Ge, характеризуемое иммуномодулирующей, антивирусной, антибактериальной и антигельминтной активностями. 2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что характеризуется противогерпесной активностью. 3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что характеризуется антиВИЧактивностью. 4. Препарат по п.1, отличающийся тем, что характеризуется противотуберкулезной активностью.