ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/53 A61K31/12 

Заявляемое изобретение относится к медицине и фармации, в частности к лечению, предупреждению и профилактике вирусных заболеваний, преимущественно вызванных преимущественно вирусом Хантаан или восточного энцефаломиелита лошадей (далее - ВсЭЛ).

Анализ меняющихся экологических условий циркуляции вируса в природе, эволюция противовирусных препаратов все более убедительно свидетельствуют о том, что одним из основополагающих подходов к проблеме профилактики и лечения вирусных инфекций должен быть анализ вирусной патологии как сложного динамического процесса, требующего постоянной корректировки стратегии и тактики борьбы с вирусными инфекциями.

В силу определенных социально-политических причин возрастает эпидемическая опасность заноса возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций и распространение их на территории нашей страны (см., например, Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Я. Актуальные направления совершенствования профилактики инфекционных болезней // Эпидемиол. и инф. болезни. - 2000. - №1. - С.4-8).

Одной из серьезных проблем здравоохранения являются природно-очаговые вирусные инфекции, среди которых лидируют вирусные геморрагические лихорадки (см., например, Chu J.-K., Jennings G.B., Schmaljohn C.S. A vaccinia virus-vectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul virus but not Puumala virus // J.Virol. - 1995. - Vol.69, №10. - P.6417-6423; Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., Липская Г.Ю. и др. Генетическая дифференциация хантавирусов с помощью полимеразной реакции и секвенирования // Вопр. вирусол. - 1996. - №1. - С.24).

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - острая вирусная природно-очаговая инфекция человека, характеризующаяся полиморфизмом клинических проявлений с вовлечением в патологический процесс практически всех органов и систем, тяжелым течением и развитием серьезных осложнений. Заболевание протекает с выраженными инфекционно-токсическими и геморрагическим проявлениями, поражением почек и развитием острой почечной недостаточности. В последнее время ГЛПС приобретает все большее значение в патологии человека и выходит на одно из ведущих мест среди других природно-очаговых инфекций.

ГЛПС занимает ведущее место среди зоонозных вирусных инфекций и одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. На территории Российской Федерации расположен один из самых крупных и активных мировых очагов ГЛПС. В РФ эндемичны по ГЛПС 61 из 89 административных территорий. Причем 97% случаев выявлено в Европейской части РФ и 3% - в Азиатской части, главным образом, на Дальнем Востоке (см., например, Ткаченко Е.А., Дроздов С.Г., Федоров Ю.М. Хантавирусы и хантавирусные инфекции // Сб. тез. докл. науч. конф. ИПВЭ «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», г.Москва, 23-25 ноября 1999 г. - М., 1999. - Т.2. - С.88).

Ежегодно в мире регистрируют приблизительно 200 тысяч случаев заболевания ГЛПС, выделено более 500 штаммов хантавирусов - из них на территории бывшего Советского Союза - 120 (см., например, Щербакова С.А., Попов Н.В., Добло А.Д. и др. Некоторые результаты и перспективы изучения циркуляции вируса ГЛПС на территории Саратовской области // Сб. науч. трудов «Проблема особо опасных инфекций». - Саратов, 2000. - Вып.№80. - С.48-52).

Все вышесказанное определяет актуальность изучения новых антивирусных препаратов для профилактики и терапии актуальных вирусных инфекций. Отсутствие эффективных неспецифических противовирусных препаратов в отношении природно-очаговых вирусных инфекций РФ стимулирует активизацию работ по синтезу новых соединений различной химической структуры.

Химиопрепараты имеют гораздо меньше противопоказаний к применению, чем вакцины. Для хранения не требуются передвижные холодильники (рефрижераторы) и нет необходимости проведения биопроб перед непосредственным применением. При этом показано применение неспецифических препаратов для людей с нарушенным иммунитетом. Таким образом, химиопрепараты являются альтернативным средством лечения и профилактики опасных и особо опасных вирусных инфекций, особенно инфекций, в отношении которых не разработаны специфические средства защиты.

Многолетние исследования показали, что лучшие из противовирусных веществ либо селективно ингибируют отдельные этапы вирусной репродукции, либо опосредованно действуют через клетку-хозяина. Весьма перспективной группой противовирусных препаратов являются аномальные нуклеозиды и их производные (см., например, Ершов Ф.И. Лекарства против вирусов // Materia Medica (бюл. Для врачей и фармацевтов). - 1996. - №2(10). - С.5-13).

К настоящему времени тактика изучения эффективности химиопрепаратов для ряда вирусных инфекций описана в литературе (см., например. Вотяков В.И., Боренко Е.И. Подход к оценке активности химических соединений против вирусов, размножающихся в тканевых культурах // Методические вопросы научной разработки противовирусных веществ. - Минск, 1977. - С.10-14; Чижов Н.П. Экспериментальные методы и критерии оценки ингибирующей активности противовирусных веществ. - Минск, 1977. - C.36-41).

Доклиническое изучение препарата складывается из нескольких этапов: изучение эффективности препаратов в культуре клеток и на лабораторной модели, воспроизводящей ведущий синдром заболевания и имеющей сходство клиники, патогенеза инфекции, протекающей у человека.

Отмечается сложность изучения хантавирусных инфекций, так как это сопряжено с поиском экспериментальной формы инфекции у животных. Анализ данных литературы свидетельствует, что эта проблема до настоящего времени не имела положительного решения.

Одним из перспективных противовирусных лекарственных соединений для лечения вируса Хантаан или ВсЭЛ является натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат (далее - Средство).

Из уровня техники известно биологически активное соединение, защищающее от инфекций, вызываемых вирусами лихорадки долины Рифт, а также активного в отношении вируса ЗЭЛ, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса, инфекционного ляринготрахеита птиц, всего 10 РНК и ДНК, содержащих вирусов (см. патент на изобретение №2294936 «Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат, обладающая противовирусной активностью», дата подачи 29.06.2005 г., опубликовано 10.03.2007 г.).

К настоящему времени стратегия отбора эффективных неспецифических медицинских средств защиты для ряда вирусных инфекций описана в Руководствах по доклинической оценки лекарственных средств (см. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., Минздрав РФ, 2005).

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, является расширение ассортимента лекарственных средств, обладающих широким спектром действия и предназначенных для лечения, предупреждения и экстренной профилактики вируса Хантаан или ВсЭЛ.

Указанный технический результат достигается тем, что для лечения, предупреждения и экстренной профилактики инфекционных заболеваний и состояний вирусной этиологии, вызываемых вирусами Хантаан или ВсЭЛ, применяют противовирусное лекарственное Средство - натриевую соль 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат.

При этом заболевание или состояние представляет собой геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (вызываемую вирусом Хантаан) или ВсЭЛ. Лекарственное Средство предназначается для системного введения с использованием дозированного количества, например в количестве 50 мг/кг - для предупреждения заболевания и экстренной профилактики.

Лекарственное Средство, выполненное в виде раствора, таблеток или капсул, предназначено для введения человеку, домашним или сельскохозяйственным животным перорально или в виде инъекций.

Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «новизна».

Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».

Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного выполнения.

Исследования для оценки эффективности лекарственного Средства в отношении вирусов Хантаан или ВсЭЛ в сопоставлении с контролем в культуре клеток и на лабораторных животных проводили по следующим направлениям:

- оценка величины максимально переносимой дозы (МПД);

- оценка противовирусной эффективности Средства в отношении возбудителей ГЛПС в монослое культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) по подавлению уровня репродукции вирусов;

- выбор лабораторной модели для изучения эффективности Средства в отношении экспериментальных форм ГЛПС;

- оценка эффективности Средства на лабораторных животных, инфицированных возбудителями ГЛПС и восточного энцефаломиелита лошадей, при использовании схем экстренной профилактики и лечения.

Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами (см. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: «Высшая школа». - 1990).

В работе использовали вирус Хантаан (возбудитель ГЛПС) и вирус восточного энцефаломиелита лошадей.

Для моделирования летальной формы ГЛПС использовали двухнедельных белых мышей-сосунков, для моделирования экспериментальной форм ВсЭЛ - белых мышей массой 8-10 г.

Наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 суток, при этом контролировали гибель животных дважды в течение дня.

Токсичность Средства оценивали на неинфицированных двух- и четырехнедельных мышах.

Основным критерием оценки эффективности являлся показатель защиты животных от гибели (процент) при проведении испытаний in vivo и подавление репродукции вируса при проведении испытаний in vitro. В качестве дополнительных критериев служили: среднее время жизни (дни) и уровень подавления репродукции вируса в тканях головного мозга (Δ, lg).

Пример 1.

Оценку эффективности Средства в отношении вируса Хантаан проводили в культуре клеток СПЭВ по подавлению репродукции исследуемых возбудителей в присутствии химиопрепаратов. Уровень накопления вируса в культуре клеток оценивали титрованием методом формирования негативных колоний.

Двухсуточный монослой культуры клеток СПЭВ заражали вирусом в дозе 0,02 БОЕ/кл при температуре (37±0,5)°С. Для вируса Хантаан время адсорбции составляло 90 мин. После адсорбции монослой клеток отмывали 3 объемами среды поддержания, в пробирки вносили свежую среду с различными концентрациями Средства (от 1 до 100 мкг/мл). На каждую дозу Средства использовали 4 пробирки с монослоем клеток. Инкубацию проводили при (37±0,5)°С для вируса Хантаан в течение 7 суток. По окончании срока инкубации проводили криодеструкцию клеток и определяли уровень накопления вируса по формированию негативных колоний в культуре клеток GMK-АН-1(Д) для вируса Хантаан. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 Оценка противовирусной эффективности Средства in vitro в отношении вируса Хантаан (возбудителя ГЛПС) Концентрация препарата, мкг/мл Средство титр вируса, lgБOE/мл снижение титра, Δ, lg 100 3,0 2,0 50 3,5 1,5 20 3,8 1,2 10 3,8 1,2 5 3,9 1,1 1 4,8 0,2 Контроль (без препарата) 5,0 -

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что только Средство в достаточно большой концентрации значимо подавляет репродукцию вируса Хантаан (наблюдали 100-кратное снижение репродукции вируса).

Пример 2. Изучение ингибирующего действия Средства на возбудитель ГЛПС проводили на белых мышах-сосунках 12-суточного возраста, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, в дозе 6 lgБOE.

Эффективность Средства оценивали по клиническим проявлениям и гибели животных, титр вируса определяли по методу И.П.Ашмарина и соавт. (см. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбролов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов. - Л., 1975. - 103 с.).

С учетом величины острой токсической дозы была выбрана рабочая доза Средства - 50 мг/кг массы животного.

Оценку эффективности Средства проводили по следующим схемам:

1. Схема экстренной профилактики - животным вводили вируссодержащую суспензию в объеме 0,1 мл подкожно. Средство вводили через 2 ч после инфицирования перорально и далее раз в сутки в течение 5 дней в рабочей дозе.

2. Схема лечения - животным вводили вируссодержащую суспензию в объеме 0,1 мл подкожно, через 24 ч после инфицирования вводили Средство перорально и далее раз в сутки в течение 4 дней в испытуемой дозе.

Результаты оценки противовирусной эффективности Средства при пероральном введении беспородным белым мышам-сосункам, инфицированным подкожно вирусом Хантаан, представлены в таблице 2.

Таблица 2 Противовирусная эффективность Средства в отношении экспериментальной формы хантавирусной инфекции Препарат Схема введения препарата Количество погибших мышей Среднее время жизни, сутки Защита от гибели, процент Снижение уровня накопления вируса в мозгу, Δ, lg Средство +2, +24, 48, 72, 96, 120 18/22 11,7 16,7 5,0 1,8 Контроль (без препарата) - 32/32 8,5 - 6,8 - Контроль стада - 0/20 21,0 - -

Следует отметить, что в опытной группе наблюдали значительное удлинение срока жизни.

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что применение Средства в целях экстренной профилактики более эффективно подавляет размножение вируса в тканях головного мозга. Для Средства кратность подавления составила почти 100.

Таким образом, удлинение срока жизни животных в опытной группе и снижение уровня накопления вируса в головном мозгу свидетельствуют о положительном влиянии исследуемого Средства на динамику инфекционного процесса при использовании препаратов для экстренной профилактики экспериментальной хантавирусной инфекции.

Пример 3.

Для изучения противовирусного действия Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей (доза инфицирования 10 ЛД₅₀) использовали схему введения 1 и 2.

Схема 1. Средство вводили мышам перорально в дозе 50 мг/кг через 2 ч после инфицирования и далее ежедневно в течение 5 дней один раз в сутки.

Схема 2. Средство вводили мышам перорально в дозе 50 мг/кг через 24 ч после инфицирования и далее ежедневно в течение 4 дней один раз в сутки.

В таблице 3 представлены данные изучения эффективности Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей при парентеральном инфицировании.

Защитная эффективность Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей при введении его животным по схеме экстренной профилактики составила 50,0%; удлинение среднего времени жизни в группе животных составило 7,2 дня.

Таблица 3 Оценка противовирусной активности Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ Препарат Схема Количество животных в опыте, шт Количество павших животных, шт Защита от гибели, процент Средняя продолжительность жизни, день Подавление репродукции вируса в головном мозгу, Δ, lg Средство №1 30 8 73,3 16,9 7,1 1,3 №2 30 9 70,0 15,7 7,2 1,2 Контроль дозы 36 36 - 3,9 8,3 - Контроль стада 30 0 - - - Контроль плацебо 30 0 - - -

Средство проявило высокую защитную эффективность в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей при введении его животным по схеме экстренной профилактики, защита от гибели составила 73,3%; удлинение среднего времени жизни в группе животных составило 13,0 дней.

В группе леченых животных значительно увеличился показатель среднего времени жизни. Средство проявило высокую защитную эффективность (73,3%) в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ.

Таким образом, лекарственное Средство - натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат в ходе исследования умеренно эффективно в отношении вируса Хантаан в дозе 50 мг/кг. При применении Средства по схемам экстренной профилактики и лечения обладает высокой защитной эффективностью против возбудителей ВсЭЛ при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Заявляемое изобретение способствует расширению ассортимента лекарственных средств, обладающих широким спектром действия и предназначенных для лечения, предупреждения и экстренной профилактики вирусных инфекций, в частности, вызванных вирусом Хантаан или восточного энцефаломиелита лошадей (далее - ВсЭЛ).

Группа изобретений относится к области ветеринарии. Заявлено применение противовирусного средства натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат для профилактики и лечения вирусных заболеваний и состояний, вызванных вирусом Хантаан или вирусом восточного энцефаломиелита лошадей. Заявлен способ лечения вирусных заболеваний и состояний, вызванных вирусом Хантаан или вирусом восточного энцефаломиелита лошадей, путем введения указанного лекарственного средства. Заявленная группа изобретений эффективна для лечения, предупреждения и экстренной профилактики вируса Хантаан и восточного энцефаломиелита лошадей. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Применение противовирусного средства натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат (Средство) для профилактики и лечения вирусных заболеваний и состояний, вызванных вирусом Хантаан или вирусом восточного энцефаломиелита лошадей.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что заболевание или состояние представляет собой геморрагическую лихорадку с почечным синдромом или восточный энцефаломиелит лошадей.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство предназначено для системного введения.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что используют дозированное количество лекарственного средства.

5. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство предназначено для введения человеку, домашним или сельскохозяйственным животным.

6. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство вводят перорально.

7. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство вводят в виде инъекций.

8. Применение по п.6, отличающееся тем, что для профилактики и лечения заболеваний количество средства в каждом дозированном количестве составляет 50 мг/кг.

9. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство выполнено в виде таблеток.

10. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство выполнено в виде капсул.

11. Применение по п.1, отличающееся тем, что средство выполнено в виде инъекционной формы.

12. Способ профилактики и лечения состояний, вызванных вирусами Хантаан или восточного энцефаломиелита лошадей у человека или животного, отличающийся тем, что включает введение лекарственного средства - натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрат.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что предназначен для профилактики и лечение заболеваний.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что заболевание представляет собой геморрагическую лихорадку с почечным синдромом или восточный энцефаломиелит лошадей.

15. Способ по п.12, отличающийся тем, что заболевание вызвано вирусом Хантаан или вирусом восточного энцефаломиелита лошадей.

16. Способ по п.12, отличающийся тем, что введение средства осуществляют дозированным количеством.

17. Способ по п.12, отличающийся тем, что средство вводят перорально.

18. Способ по п.16, отличающийся тем, что для лечения и экстренной профилактики заболевания количество лекарственного средства в каждом дозированном количестве составляет 50 мг/кг.

19. Способ по п.12, отличающийся тем, что средство выполнено в виде таблеток или в виде капсул.

20. Способ по п.12, отличающийся тем, что средство вводят в виде инъекций.

21. Способ по п.12, отличающийся тем, что средство выполнено в виде инъекционной формы.