СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КРЕАТИНИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицинской биохимии, аналитической химии, а именно к созданию способов, позволяющих количественно определить креатинин в сыворотке крови и моче колориметрическим методом.

В настоящее время в медицинской практике для определения содержания креатинина в биологических жидкостях используют два основных способа: ферментативный способ, основанный в основном на реакции креатинина с креатининфосфокиназой, и колориметрический способ, основанный на реакции Яффе взаимодействии креатинина с пикриновой кислотой. Продуктом реакции Яффе является пикрат креатинина, который в щелочной среде имеет оранжевую окраску. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации креатинина.

Ферментативные способы сложны и дорогостоящи, поэтому в России используют в основном колориметрические способы. Однако реакция Яффе, лежащая в основе всех колориметрических методов, неспецифична. Пикриновая кислота при взаимодействии с целым рядом веществ (белки, глюкоза, ацетон, ацетоуксусная и пировиноградная кислоты и т.д.) образует соединения, имеющие оранжевую или красно-оранжевую окраску, что приводит к завышению результатов анализа.

Существует два подхода к решению этой проблемы: измерять интенсивность окраски в первые минуты реакции, когда вклад примесных соединений в реакцию Яффе еще невелик (кинетические методы), и удалять примесные соединения из тестируемого образца перед анализом (колориметрические методы по конечной точке).

Известен, например, кинетический способ определения концентрации креатинина путем инкубации тестируемого образца в щелочной среде в присутствии пикриновой кислоты при температуре 37^oC с последующим определением скорости образования пикрата креатинина по двум точкам в начальный период реакции в течение 1 2 мин /1/. Однако этот способ требует не только очень высокой квалификации специалистов, но и дорогостоящего спектрофотометрического оборудования, позволяющего с высокой точностью произвести такие измерения. Сильно же завышенные концентрации глюкозы, пирувата, ацетона, аскорбата в тестируемом образце приводят к ошибочно завышенным результатам по креатинину. Поэтому этот способ не обеспечивает правильность определения концентрации креатинина в сыворотке крови и моче больных сахарным диабетом.

Наиболее ближайшим к заявляемому прототипом является способ определения концентрации креатинина, заключающийся в следующем /2/: тестируемый образец сыворотки крови депротеинезируют при помощи трихлоруксусной кислоты. Образовавшийся при этом осадок удаляют центрифугированием. Супернатант инкубируют с пикриновой кислотой в щелочной среде при комнатной температуре 20 мин и затем измеряют оптическую плотность раствора при длине волны (500 505) нм против холостой пробы. Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность калибровочной пробы, а расчет концентрации креатинина проводят по формуле
,
где Е_п оптическая плотность тестируемой пробы в щелочной среде (ед.опт. пл.);
Е_к оптическая плотность калибровочной пробы в щелочной среде (ед.опт.пл. );
177 концентрация калибратора (мкмоль/л).

Данный способ позволяет определять содержание креатинина в интервале от 25 до 880 мкмоль/л.

Коэффициент вариации не более 5%
Основным недостатком прототипа являются завышенные результаты анализа из-за вклада примесных веществ, образующих с пикриновой кислотой комплексы, имеющие оранжевую окраску, в суммарную окраску реакционной смеси, а также сложность способа из-за необходимости процедуры осаждения белков и дальнейшего отделения осадка центрифугированием.

Технической задачей изобретения является повышение точности и упрощение способа определения концентрации креатинина.

Поставленная задача достигается тем, что реакцию креатинина с пикриновой кислотой проводят последовательно сначала в щелочной среде, где образуется пикрат креатинина, имеющий оранжевую окраску, затем в кислой среде, где происходит обесцвечивание пикрата креатинина, при этом комплексы пикриновой кислоты с другими веществами окраску сохраняют. Содержание креатинина рассчитывают по разности оптических плотностей реакционной смеси в щелочной и кислой среде.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Тестируемый образец инкубируют с пикриновой кислотой в щелочной среде 20 мин при температуре (18 30)^oC и измеряют оптическую плотность при длине волны 500 нм против холостой пробы при той же длине волны. Затем в смесь добавляют буферный раствор глицин HCI до pH смеси 3,5 5,0. Смесь выдерживают 15 мин при температуре (18 30)^oC и повторно измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 500 нм. При закислении комплекс креатинина с пикриновой кислотой обесцвечивается, оставшаяся окраска относится к комплексам пикриновой кислоты с примесными веществами (белками, глюкозой, ацетоном и т. д. ). Параллельно, аналогичным образом проводят измерения оптической плотности калибровочной пробы в щелочной и кислой среде.

Расчет содержания креатинина проводят относительно оптической плотности калибровочного образца (раствора креатинина) по формуле
,
где Е_п1 оптическая плотность тестируемой пробы в щелочной среде (ед.опт. пл.);
Е_п2 оптическая плотность тестируемой пробы в кислой среде (ед.опт.пл.);
Е_к1 оптическая плотность калибровочной пробы в щелочной среде (ед.опт. пл.);
Е_к2 оптическая плотность калибровочной пробы в кислой среде (ед.опт.пл. );
150 концентрация калибратора (мкмоль/л).

Предлагаемый способ позволяет обеспечить правильность определения креатинина (100±5)% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5% в области концентраций креатинина 25 900 мкмоль/л.

На фиг. 1 представлена зависимость обесцвечивания пикрата креатинина от времени и pH реакционной смеси. Из фиг. 1 видно, что оптимум pH этой реакции лежит в интервале от 3,5 до 5,0.

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа являются следующие:
реакцию креатинина с пикриновой кислотой проводят последовательно сначала в щелочной, а затем в кислой среде при pH 3,5 5,0, что позволяет повысить точность определения креатинина за счет вычетания вклада в цветную реакцию примесных соединений, т.к. в кислой среде обесцвечивается лишь пикрат креатинина, комплексы же пикриновой кислоты с другими веществами свою окраску сохраняют;
для закисления реакционной смеси и обесцвечивания пикрата креатинина используют преимущественно буферный раствор глицин HCl в концентрации 3,2 M pH 2,2, что позволяет проводить реакцию обесцвечивания пикрата креатинина при pH 3,5 5,0 и избежать тем самым осаждения белков, которое наблюдается при pH <3,5 и мешает анализу; проведение реакции при pH > 5 не позволяет полностью обесцветить комплекс креатинина с пикриновой кислотой; использование глицин HCl буфера высокой концентрации, а именно 3,2 M pH 2,2 является преимущественным вариантом предлагаемого способа, т.к. позволяет добавлять в реакционную смесь минимальное удобное количество буфера (например, 0,05 мл). В качестве подкислителя реакционной смеси могут использоваться любые другие доступные реагенты, например смесь 4,6 N серной кислоты и 3,5 N уксусной кислоты и др.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Исследования проводили на нормальных и патологических контрольных сыворотках крови фирмы Rendox. Содержание креатинина по паспорту фирмы в нормальной сыворотке 148 мкмоль/л, в патологической 497 мкмоль/л.

Пример 1
К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 0,7 мл 30 ммоль/л пикриновой кислоты и 0,3 мл 0,28 моль/л гидрата окиси натрия. Смесь выдерживают 20 мин при температуре (18 30)^oC и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 500 нм. Затем в реакционную смесь добавляют 0,05 мл буферного раствора 3,2 M глицин HCl pH 2,2 до pH реакционной смеси 4,4. Смесь выдерживают 15 мин при температуре (18 30)^oC и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 500 нм. Рассчитывают содержание креатинина относительно калибратора.

Концентрация креатинина в нормальной сыворотке крови составляет 153 мкмоль/л, отклонение 3,3% Концентрация креатинина в патологической сыворотке крови 497 мкмоль/л, отклонение 0%
Пример 2
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но при закислении добавляют в реакционную смесь буферный раствор 3,2 М глицин HCl pH 2,2 до pH реакционной смеси 5,0.

Концентрация креатинина в нормальной сыворотке крови составляет 150 мкмоль/л, отклонение 1,4% Концентрация креатинина в патологической сыворотке крови составляет 492 мкмоль/л, отклонение 1,0%
Пример 3
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но закисление реакционной смеси проводят до pH 3,5.

Концентрация креатинина в нормальной сыворотке крови составляет 145 мкмоль/л, отклонение 2% Концентрация креатинина в патологической сыворотке крови 490 мкмоль/л. отклонение 1,4%
Пример 4
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но для закисления реакционной смеси до pH 3,5 используют смесь 4,6 N серной кислоты и 3,5 N уксусной кислоты.

Концентрация креатинина в нормальной сыворотке крови составляет 142 мкмоль/л, отклонение 4% Концентрация креатинина в патологической сыворотке крови 500 мкмоль/л, отклонение 0,6%
Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом
повысить точность определения концентрации креатинина в биологических жидкостях за счет исключения нежелательного вклада в цветную реакцию примесных соединений;
упростить способ за счет исключения длительной стадии осаждения и отделения мешающих белков.

Применение: медицинская и клиническая биохимия. Сущность изобретения: тестируемый образец крови или мочи инкубируют с пикриновой кислотой в течение 20 мин, сначала в щелочной среде с последующим измерением оптической плотности реакционной смеси, затем смесь закисляют буферным раствором глицин HCl до pH 3,5 - 5,0, инкубируют 15 мин и вновь измеряют оптическую плотность реакционной смеси. Для закисления смеси используют преимущественно 3,2 М глицин HCl буфер, pH 2,2. Концентрацию креатинина определяют по разности оптических плотностей реакционной смеси в щелочной и кислой среде. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ определения концентрации креатинина в биологических жидкостях, включающий инкубацию образца биологической жидкости в щелочной среде в присутствии пикриновой кислоты с последующим определением оптической плотности тестируемой и калибровочной проб относительно холостой пробы, отличающийся тем, что после измерения оптической плотности щелочного раствора пробы ее подкисляют до pH от 3,5 до 5,0 и повторно определяют оптическую плотность раствора относительно холостой пробы при той же длине волны, а искомую концентрацию креатинина определяют по отношению разности величин оптических плотностей тестируемой пробы в щелочной и кислой средах к разности величин оптических плотностей калибровочной пробы в щелочной и кислой средах. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для подкисления пробы используют 3,2 М глицин HCl буфер с pH 2,2.