СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ОБМЕННЫХ НАРУШЕНИЙ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Согласно современным представлениям в основе болезни лежат нарушения физико-химических процессов, структурно-функциональные молекулярные перестройки, обуславливающие нормальное течение биологических процессов (Орст А.Х. Молекулярные основы патологии болезней. М.: 1984, 454 с.).

В медицине, биологии и биофизике формируется новое направление - анализ молекулярной природы болезней обмена, выявление предпатологических молекулярных различий (Рубин А.Б.. Пытьева Н.Ф., Резниченко Г.Ю. Кинергика биологических процессов. Московск. Университет, 1987).

Справедливость принципов химической кинетики в метаболических процессах открывает широкие возможности моделирования различных способов наблюдения за патологическими обменными сдвигами в условиях in vitro. Проблема соотношения метаболизма структуры и функции приобретает все большую значимость. При этом важнейшей особенностью является то, что биологические системы сами являются источниками информации, по их динамическому структурированию, обусловленному кинетикой метаболизма, можно диагностировать метаболические блоки (Пирузян Л.А., Ландау Л.А. Вопросы медицинской биофизики. М.: 1958, 189 с.; Николис Г., Пригожий И. Самоорганизация в неравновесных системах. М.: 1979).

Диагностику обменных нарушений осуществляют путем количественного определения в сыворотке крови (СК) различных веществ путем использования различных способов: калориметрического, спектрофотометрического, ферментного, автоматического анализатора (Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред. Тица. Изд-во Лабинформ. М.: 1997).

Кроме того, обменные нарушения диагностируют визуальным наблюдением за метаболическими структурами СК человека при помощи высушивания СК в контролируемых условиях с дальнейшей микроскопией (Кн. Савина Л.В. Кристаллоскопические структуры сыворотки крови здорового и больного человека, Краснодар, 1999).

В качестве аналога использовали определение креатинина калориметрическим способом по Яффе (Поппер) (Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. /Под ред. В.В.Меньшикова. М.: 1987, с.219-222).

Принцип: креатинин реагирует с пикриновой кислотой в кислой среде с образованием ароматных соединений.

Реактивы: пикриновая кислота, соляная кислота, основной калибровочный раствор, креатинин, едкий натрий.

При определении используют набор Био-Ла-Тест “Креатинин”, Лахема, ЧССР.

Ход определения: СК смешивают с раствором пикриновой кислоты, помещают в кипящую баню, центрифугируют, к центрифугату добавляют едкий натр, воду и измеряют длину волны, строят калибровочный график и вычисляют количество креатинина.

Недостатки способа:

- нарушение нативности СК;

- использование дорогостоящих реактивов и аппаратов;

- исследование длины волны;

- косвенное определение наличия креатинина.

За прототип использован кристаллоскопический способ исследования метаболических структур СК человека. Патент №2176790 от 10.12.2001 г. “Способ дифференциальной диагностики обменных нарушений”, авторы Савина Л.В., Павлищук С.А., Самсыгин В.Ю., Болотова Е.В., Готовцева Л.П., Чекмарева С.Е.

В основе способа лежит микроскопическое кристаллоскопическое исследование капель сыворотки крови, высушенных при Т=+37-38°С. Для идентификации того или иного вида обмена предварительно готовят модельные композиты из сыворотки крови здорового человека, обогащенной калибровочными растворами различных метаболитов. Затем модельные композиты сравнивают с моделями “in vitro”, приготовленными из СК того или иного пациента.

Ход проведения способа:

1. Кровь берут из вены - 3,0 мл натощак.

2. Полученный объем центрифугируют для получения сыворотки крови.

3. Сыворотку в виде капель наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

4. Препарат сушат в термостате при Т=+37-38°С на протяжении 1,5-2 часов.

5. Выдерживают на открытом воздухе 1,5-2 часа.

6. Под микроскопом в поляризованном свете изучают картину кристаллизации и по облику в сравнении с нормой кристаллов определяют вид обменного нарушения.

Недостатки способа:

1. Взятие из вены 3,11 мл крови.

2. Длительная сушка и выдерживание препарата в сушке по 3-4 часов.

3. Применение поляризационного микроскопа.

Задачи предлагаемого изобретения:

1. Расширение информативности при диагностике нарушений обменных процессов.

2. Сокращение сроков получения информации о нарушении обменных процессов.

3. Использование малых количеств крови пациента за счет взятия ее из пальца.

4. Экспресс-диагностика наличия обменных нарушений при помощи биотеста.

Сущность изобретения заключается в том, что для экспресс-диагностики обменного нарушения в организме человека предварительно готовят эталон из водного раствора соответствующего метаболита, в который расселяют стандартный биотест - РЯСКУ ВОЛЬФИЮ БЕСКОРНЕВУЮ, выдерживают ее 40-45 минут, микроскопируют в проходящем свете и сравнивают с микроскопической картиной ряски, выдержанной в сыворотке крови пациента, и при совпадении формы, структуры, цвета биотеста, выделенного из сыворотки крови пациента со стандартным биотестом, диагностируют наличие обменного нарушения, а при несовпадении микроскопической картины - отсутствие данного обменного нарушения.

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что впервые для индикации обменных нарушений использована ряска вольфия бескорневая (ВБ). Это тест-объект - организм, обитатель пресноводных водоемов, весьма чувствителен к различным веществам, находящимся в водной среде. Его используют для проведения экологического контроля за состоянием агроэкосистем (Цаценко Л.В., Малюта Н.Г. Рясковые биоиндикаторы агроценоза. Краснодар: 2000; Вронский В.А. Прикладная экология. Ростов-на-Дону, 1996).

Сыворотка крови человека - это биологическая система, 92% которой представлены водой, остальные 8% - белками и другими компонентами (Гауровиц Ф. Химия и функция белков. М.: 1965). Нами с помощью ВБ проведено биотестирование СК пациентов с различными нарушениями обмена. Под биотестированием понимают способ исследований, при котором о качествах среды, факторах на нее действующих, судят по выживаемости, состоянию и поведению специально помещенных в эту среду организмов - тест-объектов, в данном случае - ряски вольфии бескорневой (Варфоломеев С.Д. Биосенсоры. Соросовский образовательный журнал, 1997, №1, с.45-49; Бурдин К.С. Основы биологического мониторирования. Изд-во Московский Университет, 1985).

Способ осуществляют следующим образом.

1. Из пальца пациента берут 0,2-0,3 мл крови, ее центрифугируют для получения сыворотки крови.

2. В сыворотку крови, помещенную на предметное стекло с выемкой, помещают 5-8 листецов ряски - вольфии бескорневой и выдерживают ее на протяжении 40-45 минут.

3. Тест-объект, выдержанный в сыворотке крови, микроскопируют в проходящем свете и при совпадении формы, структуры и цвета биотеста, выделенного из сыворотки крови пациента со стандартным эталоном, диагностируют наличие обменного нарушения, а при несовпадении микроскопической картины - отсутствие данного обменного нарушения.

4. Предварительно готовят эталон из водного раствора соответствующего метаболита, в который расселяют стандартный биотест - ряску вольфию бескорневую, выдерживают ее 40-45 минут и микроскопируют. Затем идентифицируют форму, структуру и цвет ВБ - теста индикатора обменных нарушений и полученного из биотеста больного.

Приводим модельные эталоны из водных растворов гормонов (тироксин - концентрация 250 нмоль/л; паратгормон - концентрация 270 нг/л), фермента трипсина (концентрация - 340 ммоль/л), глицина (аминокислота, образованная щавелевой кислотой и креатинином, концентрация глицина - 18 мг/л); креатинина (азотистое вещество, концентрация - 0,098 ммоль/л). Фото 1,2,3,4,5.

На фото 6 приведена нормальная ряска, цвет - зеленый, форма - округлая, структура не изменена (зерна хлорофилла выдержанных размеров).

Нас интересовал информационный “отклик” водных растворов метаболитов после пребывания в них ВБ. Для этого мы изучали структуру метаболитов до и спустя 40-45 минут после пребывания в растворе метаболита ВБ. Оказалось, что биологический сенсор, накапливая метаболит в своем организме, изменяет собственную форму, структуру и цвет.

На фото 7 приведена исходная структура высушенного водного метаболита глицина, которая представлена оптически активными субпараллельными шестоватыми кристаллами.

На фото 8 приведена структура глицина после пребывания в нем ВБ, уменьшилась площадь кристаллизации, появились незавершенные субпараллельные шестоватые кристаллы и сферолитоподобное плато, выполненное секторами.

На фото 9 приведена исходная кристаллограмма (КГ) креатинина, представленная оптическими активными сферолитами и отдельными агрегациями из зерен. Пребывание ВБ в водном растворе креатинина характеризовалось сокращением площади кристаллизации, появлением слабо развитых сферолитов, резецированных зон, выполненных мелкими агрегациями и отдельными зернами (фото 10).

Из приведенных данных следует вывод о способности ВБ фиксировать и ассимилировать различные метаболиты, что сказывается на изменении формы, структуры и цвета. В связи с этим можно полагать, что ВБ - это биосистема раннего оповещения метаболической поломки. Наши исследования проведены на 300 пациентах.

Пример 1, фото 1. Больной К., история болезни (ИБ) №213. Диагноз (Д-з): Диффузный токсический зоб, средняя степень тяжести, впервые выявленный.

На фото 1 приведена микроскопическая картина стандарта-эталона ряски ВБ, которая совпала с таковой при помещении ВБ в сыворотку крови больного К.

Технология: Из пальца больного К. взято 0,2 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. В нее расселено 5 листецов ВБ, которая выдержана в СК 45 минут. Затем тест-объект (ВБ), выдержанный в СК, микроскопировали в проходящем свете, изучили его форму, структуру и цвет и сравнили с эталоном-биотестом ВБ, которая была выдержана 45 минут в водном растворе тироксина. Обе микроскопические картины оказались идентичными. Одновременно в СК больного К. определили уровень гормона тироксина, он оказался повышен и составил 259 нмоль/л (норма 115 нмоль/л). Диагноз тиреотоксикоза подтвердился.

Пример 2, фото 2. Больная А., ИБ №1131 Д-з: Подозрение на гиперпаратиреоз. На фото 2 приведена микроскопическая картина стандарта-эталона ВБ, которая совпала с таковой при помещении ВБ в СК больной А.

Технология: Из пальца больной А. взято 0,3 мл крови, она отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. В нее расселена ряска ВБ - 7 листецов ВБ, которая выдержана в СК 45 минут. Затем ВБ, выдержанную в СК, микроскопировали в проходящем свете, изучили ее форму, структуру и цвет и сравнили с микроскопической картиной стандартного эталона - ВБ, которая была выдержана 45 минут в водном растворе паратгормона. Обе микроскопические картины совпали. Одновременно в СК больной А. определили уровень паратгормона, он оказался повышен и составил 393 нг/л (норма 270 нг/л). Диагноз гиперпаратиреоза подтвердился.

Пример 3, фото 3. Больной И., ИБ №479. Д-з: Острый панкреатит. Гиперферментемия (гипертрипсинемия?).

На фото 3 приведена микроскопическая картина стандартного эталона ВБ, которая совпала с таковой при помещении ВБ в СК больного И.

Технология: Из пальца больного И. взято 0,2 мл крови, она отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. В нее расселена ВБ - 8 листецов, которая выдержана в СК 40 минут. Затем ВБ, выдержанную в СК. микроскопировали в проходящем свете, изучили ее форму, структуру и цвет и сравнили с микроскопической картиной стандартного эталона ВБ, которая была выдержана 45 минут в водном растворе, обогащенном ферментом трипсином. Обе микроскопические картины совпали. Одновременно в СК был определен уровень трипсина, он оказался повышен и составил 337 ммоль/л (норма - 220 ммоль/л). Гиперферментемия (гипертрипсинемия) подтвердилась.

Пример 4, фото 4. Больной П., ИБ №1268. Д-з: Хроническая обструктивная болезнь легких. Подозрение на гиперглицинемию.

На фото 4 приведена микроскопическая картина стандартного эталона ВБ, которая совпала с таковой при помещении ВБ в СК больного П.

Технология: Из пальца больного П. взято 0,3 мл крови, она отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. В нее расселена ВБ - 7 листецов, которая выдержана в СК 40 минут. Затем ВБ, выдержанную в СК, микроскопировали в проходящем свете, изучили ее форму, структуру и цвет и сравнили с микроскопической картиной стандартного модельного эталона ВБ, которая была выдержана в водном растворе, обогащенном глицином. Обе микроскопические картины совпали. Одновременно в СК был определен уровень глицина, который оказался повышен - 48 мг/л (норма 18 мг/л). Гиперглицинемия подтвердилась.

Пример 5, фото 5. Больная Ш., ИБ №1247. Д-з: Хронический гломерулонефрит. Подозрение на гиперкреатинемию.

На фото 5 приведена микроскопическая картина стандартного эталона ВБ, которая совпала с таковой при помещении ВБ в СК больной Ш.

Технология: Из пальца больной Ш. взято 0,2 мл крови, она отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. В нее расселена ВБ - 6 листецов, которая выдержана в СК 45 минут. Затем ВБ, выдержанную в СК, микроскопировали в проходящем свете, изучили ее форму, структуру и цвет и сравнили с микроскопической картиной стандартного модельного эталона ВБ, которая была выдержана в водном растворе, обогащенном креатинином. Обе микроскопические картины совпали. Одновременно в СК определили уровень креатинина, который оказался повышенным и составил 0,097 ммоль/л (норма 0,044 ммоль/л). Гиперкреатинемия подтвердилась.

При использовании способ позволяет.

1. Упростить операции определения обменных нарушений.

2. Исключить применение сложных химических веществ и технического оснащения.

3. Сократить расходы на диагностику ввиду использования дешевого тест-объекта - ряски вольфии бескорневой.

4. Применение способа позволяет повысить достоверность и информативность получения результатов, проводить экспресс-диагностику обменных нарушений.

Изобретение относится к медицине, биологии, биотехнологии и может быть использовано для диагностики и прогнозирования обменных нарушений в организме человека. Предложен способ диагностики обменных нарушений с помощью биотеста индикатора ряски вольфии бескорневой. Способ заключается в том, что предварительно готовят эталон из водного раствора соответствующего метаболита, в который расселяют стандарты и биотест - ряску вольфию бескорневую, выдерживают ее 40-45 минут, микроскопируют и сравнивают с микроскопической картиной ряски, выдержанной в сыворотке крови пациента, и при совпадении формы, структуры и цвета биотеста, выделенного из сыворотки крови пациента со стандартным биотестом, диагностируют наличие обменного нарушения, а при несовпадении микроскопической картины отсутствие данного обменного нарушения. Технический результат: способ прост в исполнении, не требует больших материальных затрат и может быть использован для экспресс-диагностики обменных расстройств. 10 ил.

Способ экспресс-диагностики обменного нарушения в организме человека, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что предварительно готовят эталон из водного раствора соответствующего метаболита, в который расселяют стандартный биотест ряску вольфию бескорневую, выдерживают ее 40-45 мин, микроскопируют в проходящем свете и сравнивают с микроскопической картиной ряски, выдержанной в сыворотке крови пациента, и при совпадении формы, структуры, цвета биотеста, выделенного из сыворотки крови пациента, со cтандартным биотестом диагностируют наличие обменного нарушения, а при несовпадении микроскопической картины - отсутствие данного обменного нарушения.