СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ И КРЕАТИНИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и касается видов патологии или состояний организма, связанных с нарушениями азотистого обмена, особенно при различных видах почечной патологии, обширных хирургических ранах, ожогах.

В последние годы в связи с возрастающей опасностью заражения СПИДом или другими вирусными инфекциями во всем мире усилия исследователей направлены на разработку неинвазивных методов диагностики. Наличие таких методов особенно актуально тогда, когда это касается хронических заболеваний, при которых необходим постоянный контроль за уровнем тех или иных показателей.

Исследование состояния азотистого обмена представляет исключительный интерес как при различных хронических заболеваниях почек, так и при различных осложнениях, связанных с оперативными вмешательствами, травмами, ожогами, при заболеваниях, приводящих к нефропатиям. К числу последних относится, в частности, сахарный диабет, длительное и тяжелое течение которого сопровождается нефропатией, являющейся нередко одной из причин летального исхода. В таких случаях возникает необходимость в постоянном контроле за состоянием азотистого обмена, отражением которого служат такие показатели, как содержание мочевины и креатинина. При этом неинвазивный способ их определения как исключающий риск инфицирования и травматичности особенно важен, в частности, для больных, страдающих инсулинозависимым диабетом (и особенно для детей). Кроме того, существенный интерес для таких больных может представить метод, позволяющий провести исследование при любой тяжести состояния больного, например, при коматозных состояниях, хронических состояниях любой этиологии.

В связи с этим наличие быстрого неинвазивного метода, отражающего функцию почек, представляет большой интерес для современной коррегирующей терапии. Наиболее подходящими биологическими жидкостями могут быть пот и слеза, получение которых возможно даже при коме.

В настоящее время существует ряд способов для определения содержания мочевины и креатинина в таких биологических жидкостях, как кровь, моча. Наиболее близкими по достигаемому техническому результату к предложенному решению являются способы определения креатинина и мочевины в пробе крови:
способ определения креатинина основан на его взаимодействии в щелочной среде с пикриновой кислотой с образованием оранжево-красного окрашивания (Меньшиков В. В. Микрометоды биохимического и иммуноферментного анализа. М: Медицина, 1994, c.205-213);
способ определения мочевины основан на ее взаимодействии с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде с образованием окрашенного соединения (там же, c.241-252).

Недостатком вышеуказанных способов является необходимость забора пробы крови, что увеличивает возможность инфицирования каким-либо вирусом, и предварительная депротеинизация полученной пробы крови.

Задачей изобретения является создание способа определения мочевины и креатинина в таких биологических жидкость, как пот и слеза, исключающего риск инфицирования и устраняющего болевые ощущения, возникающие при взятии крови при инвазивной диагностике.

Способ определения вышеуказанных показателей в пробе пота осуществляют следующим образом.

У пациента потоотделение вызывали одним из потогонных препаратов (парасимпатомиметиком) пилокарпином, ацетилхолином или каким-либо другим препаратом из этой группы веществ с одновременным введением антихолинэстеразного препарата физостигмина, прозерина, галантамина или оксазила, предотвращающих деградацию ацетилхолина, присутствующего в нервных окончаниях потовых желез, и тем самым обеспечивающих процесс потоотделения. Эти препараты вводили в кожу методом ионтофореза, применяя ток плотностью 0,25-1 мА/см² в течение 5-15 мин. Предварительно участок кожи (предплечье или ладонь) тщательно промывали водой. Введение 0,1-1%-ного раствора пилокарпина (или 0.02% -ного раствора ацетилхолина) и одновременно прозерина в концентрации 10^-5 10^-8 М (или физостигмина в концентрации 10^-5 10^-8 М) сопровождалось появлением под анодом (или вокруг него) пота, который скапливается в течение 5-15 мин под пластмассовой чашечкой, плотно прижатой к коже и затем собирается количественно микропипеткой.

Содержание мочевины и креатинина в поте, а для сравнения в крови, определяли, как описано в примере 1. Для определения креатинина в поте необходимое количество пота составляло 40-50 мкл (что вызвано невысоким содержанием креатинина в поте), а для определения мочевины в поте достаточно 10 мкл, как и для определения в крови.

Обследованию подвергались мужчины и женщины (добровольцы, 15 человек) в возрасте 20-65 лет. Зависимость содержания мочевины и креатинина в поте от их уровня в крови приведена в таблице.

Пример 1. У пациента X. 25 лет, натощак вызывали потоотделение в области предплечья с помощью раствора пилокарпина в концентрации 0,1-1,0% и прозерина (10^-7М). Препараты вводили, используя ионтофорез. Выделяющийся пот собирали количественно и в нем определяли содержание мочевины и креатинина, как описано ниже. Одновременно проводили определение мочевины и креатинина в крови.

Определение мочевины проводили унифицированным методом по цветной реакции с диацетилмонооксимом (или с помощью стандартных наборов фирмы "Лахема"). Принцип метода. Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенное соединение.

Растворы:
1. Cтандартный раствор мочевины 16,65 ммоль/л
2. Диацетилмонооксим 0,5 ммоль + тиосемикарбазид 0,08 ммоль + соль железа трехвалентного 2,5 ммоль
растворяют в мерной колбе емкостью 50 мл в приблизительно 30 мл дист. воды при повышенной температуре. После охлаждения доливают водой до метки. Раствор устойчив при комнатной температуре в течение нескольких недель. Наличие небольшого количества нарастворимого осадка не мешает определению.

3. Кислота серная 0,9 ммоль/л
4. Трихлоруксусная кислота 50 г/л
Рабочий раствор:
Смешивают одну часть раствора 2 с одной частью раствора 3, ежедневно.

Ход определения мочевины в поте, слезе или крови. Длина волны 490-540 нм, кювета 1 см.

В тонкостенную пробирку отмеривают 10 мкл пота, слезы или сыворотки крови, предварительно депротеинизированной, добавляют 2,0 мл рабочего раствора и содержимое перемешивают, пробирку закрывают алюминиевой фольгой и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем содержимое пробирки быстро охлаждают и измеряют оптическую плотность пробы (А₁) и параллельно обработанного стандартного раствора мочевины (А₂) против контрольного раствора ( дист. вода). Измерение должно быть проведено не позднее 15 мин.

Расчет:
Мочевина (ммоль/л) 16,65•A₁/A₂.

Определение креатинина. Принцип метода. В щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке проводят после депротеинизации, в поте или слезе без таковой.

Растворы:
1.Стандартный раствор креатинина 442.5 мкмоль/л
2.Альбумин 20 г/л
3.Триххлоруксусная кислота 1,22 моль/л
4.Пикриновая кислота 0.04 моль/л
5.Натрия гидроокись 0,75 моль/л
Калибровочный раствор:
Калибровочный раствор креатинина 177 мкмоль/л приготовляют смешиванием 4,0 мл стандартного раствора креатинина с 6 мл раствора альбумины. При температуре 5^o раствор устойчив минимально 1 неделю.

Ход определения креатинина в поте, слезе или крови. Длина волны 500-510 нм, микрокювета.

К 50 мкл пота или слезы добавляют, 200 мкл раствора N 4,200 мкл раствора N 5, перемешивают и точно через 20 мин измеряют оптическую плотность пробы (А₁) и параллельно обработанного стандартного раствора креатинина (А₂) против контрольного раствора (дист. вода). Стандартный раствор креатинина и сыворотку предварительно депротеинизируют.

Расчет:
Креатинин (ммоль/л) 177•A₁/A₂.

Содержание в поте мочевины составляло 7,1 ммоль/л, креатинина 15 мкмоль/л; содержание в крови мочевины составляло 7,6 ммоль/л, креатинина 90 мкмоль/л;
Пример 2. У пациента У. 65 лет, натощак, вызывали потоотделение с помощью ацетилхолина (0,05 М) и физостигмина (10^-6М) и определение содержания мочевины и креатинина в поте и крови проводили, как описано в примере 1.

Содержание в поте мочевины составляло 5,5 ммоль/л, креатинина 10,1 мкмоль/л; содержание в крови мочевины составляло 6,0 ммоль/л, креатинина 65 мкмоль/л;
Способ определения мочевины и креатинина в слезе осуществляется следующим образом.

Слезоточивость вызывали нашатырным спиртом. Для этого ватный тампон, смоченный нашатырным спиртом (либо кусочек лука подносится к глазу. Через 1-2 мин выделяющуюся слезу собирали в углу глаза микропипеткой.

Содержание мочевины и креатинина в слезе, а для сравнения в крови определяли, как описано в примере 1. Для определения креатинина в слезе необходимое количество ее составляло 40-50 мкл, а для определения мочевины достаточно 10 мкл.

Обследованию подвергались те же пациенты, что и при исследовании пота. Зависимость содержания мочевины и креатинина в слезе от их уровня в крови приведена в таблице.

Пример 3. У пациента X. 38 лет, проводили определение содержания мочевины и креатинина в слезе и крови, как описано в примере 1.

Содержание в слезе мочевины составляло 5,8 ммоль/л, креатинина 65,5 мкмоль/л; содержание в крови мочевины составляло -6,0 ммоль/л, креатинина 69 мкмоль/л;
Из данных таблицы видно, что в норме при содержании мочевины в крови от 2,5 до 8,3 ммоль/л, содержание мочевины в поте находится в тех же пределах при содержании креатинина в крови в пределах от 53 до 115 мкмоль/л предел содержания креатинина составляет от 5 до 22 мкмоль/л.

В слезе содержание соответствует таковому в крови мочевины и креатинина.

Таким образом, предлагаемый способ определения мочевины и креатинина позволяет определять эти соединения в поте или слезе, имея при этом возможность судить об уровне мочевины и креатинина в крови, т.е. позволяет не прибегать к инвазивной диагностике.

Использование: медицина, для определения мочевины и креатинина в биологических жидкостях. Сущность: определение проводят колориметрическим методом в пробах слезы или пота, при этом потоотделение осуществляют введением в кожу методом ионтофореза парасимпатомиметика в присутствии антихолинэстеразного препарата, а слезоотделение вызывают с помощью тампона, смоченного нашатырным спиртом или соком лука. 1 табл.

Способ определения содержания мочевины и креатинина в биологических жидкостях колориметрическим методом, отличающийся тем, что определение проводят в поте и слезе, при этом потоотделение осуществляют с помощью парасимпатомиметика, вводимого в кожу методом ионтофореза, в присутствии антихолинэстеразного препарата, а слезоотделение вызывают с помощью тампона, смоченного нашатырным спиртом или соком лука.