СОРБЕНТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК B01J20/30 G01N30/48 

Изобретение относится к области химии, в частности к способам получения аффинных сорбентов и их использованию в хроматографии.

Известен способ получения носителя для хроматографии на основе поливинилового спирта, путем окисления последнего перйодатом натрия, выдержки при pH 1, t= 37^oC в течение 48 ч до получения геля в форме блока с последующей его гомогенизацией и обработкой при pH 1, t=37^oC в течение 48 ч 5%-ным раствором глутарового альдегида (авт. св. СССР N 1789532, 1993).

Недостатком известного способа является его двухстадийность и невысокая степень сшивки полученного носителя.

Известен способ получения сорбентов для иммобилизации ферментов путем сшивания поливинилового спирта глутаровым диальдегидом с последующей модификацией полученного геля этилендиамином (Журнал "Биоорганическая химия", т. 5, N 5, 1979). Известен также способ получения сорбента для иммобилизации ферментов путем сшивания поливинилового спирта глутаровым диальдегидом с одновременным введением комплексообразующих остатков триэтилентетрамина (Журнал "Биоорганическая химия", том 7, N 1, 1981)
Однако полученные сорбенты не эффективны для определения гликозилированного гемоглобина.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является сорбент на основе поливинилового спирта, стабилизированного глутаровым альдегидом с иммобилизованной аминофенилборной кислотой при содержании бора 0,05 0,12 мас. и используемый для определения гликозилированного гемоглобина. Известен также способ его получения, заключающийся в окислении поливинилового спирта перйодатом натрия, добавлении соляной кислоты до pH 1, выдержки в течение 48 ч, стабилизации равным объемом 5% раствора глутарового альдегида, отмывки водой, затем карбонатным буфером, иммобилизации полученного носителя аминофенилборной кислотой в растворе карбонатного буфера с pH 9,0-9,5, добавления β-аланина, выдержки, добавления порошка боргидрида натрия, промывки вначале кислым (pH 4), затем щелочными (pH 8) растворами. После отделения сорбента его рекомендовано заливать 50%-ным глицерином и хранить при t= -20^oC. (Гарипова М.И. Автореферат диссертации на соискание степени кандидата биохим. наук "Разработка носителя для аффинной хроматографии и создание сорбента для очистки интерферона", М. 1994 г. с. 10-17).

Недостатками известного технического решения являются двухстадийность получения носителя, а также малый процент бора в полученном сорбенте, что дает невысокую степень разделения при хроматографии.

Задачей изобретения является разработка сорбента на основе поливинилового спирта, сшитого глутаровым альдегидом с иммобилизованной аминофенилборной кислотой, характеризующегося высокой разделительной способностью, в частности при хроматографическом выделении гликозилированного гемоглобина, а также разработка простого и надежного способа его получения.

Поставленная задача решается описываемым сорбентом на основе поливинилового спирта, стабилизированного глутаровым альдегидом с иммобилизиванной аминофенилборной кислотой при pH 7,4±0,5 до содержания связанного бора 0,37-0,45 мас. и используемого для определения гликозилированного гемоглобина.

Поставленная задача решается также описываемым способом получения сорбента, включающим смешение 8-12% раствора поливинилового спирта с 24-26% водным раствором глутарового диальдегида при их объемном соотношении (4,5-5,5): 1, добавление концентрированной соляной кислоты до pH 1,0±0,1, вызревание геля, промывку, обработку полученного носителя раствором аминофенилборной кислоты в фосфатном буфере pH 7,4±0,5, выдержку, предпочтительно, в течение 10-14 ч, добавление боргидрида натрия, преимущественно, в течение 4 ч в два приема равными порциями, промывку водой, добавление хлоридратгидроксиламина, выдержку в нем, предпочтительно, в течение 10-14 ч и отделение сорбента. Процесс проводят до получения сорбента, содержащего 0,37-0,45 мас. B.

Сущность процесса заключается в том, что в результате сшивки поливинилового спирта

с глутаровым альдегидом CHO (CH₂)₃ CHO получают следующую структуру фрагмента матрицы носителя:

После этого на носитель иммобилируют аминофентилборную кислоту. Происходит связывание по -CHO-группам с последующим восстановлением боргидрида Na:

При заявленных условиях получают сорбент, содержащий 0,37-0,45 мас. позволяющий обеспечить высокую разделительную способность при определении гликозилированного гемоглобина. Сорбент обладает высокой стабильностью, на одной пробе достоверно воспроизводится до 20 анализов капиллярной крови человека.

Пример 1 (осуществление способа)
Сырье:
отечественный поливиниловый спирт (ПВС) с м.в.20 000 D (по вязкости). Степень дезацетилирования около 80%
25% водный p-p глутарового диальдегида (ГА).

Реагенты использовали без предварительной очистки.

Синтез матрицы.

50 г ПВС растворяют в 5000 мл воды при 80^oC в течение 2 ч. Раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют 100 мл р-ра 25% ГА. Смесь перемешивают 30 мин, и медленным добавлением по каплям конц. HCl при перемешивании доводят pH до 1. С началом гелеобразования перемешивание прекращают. Блок геля инкубируют ночь при комнатной температуре. Блок геля измельчают механически, проливают через сито, промывают водой, отмучивают мелкую фракцию и хранят в набухшем состоянии в воде.

Модификация аминофенилборной кислотой.

91 мл сорбента + 150 мл 0.1 М фосфатного буфера pH 7.4, содержащего 3.7 г аминофенилборной кислоты, выдерживают 12 ч, добавляют 1.13 г x 2NaBH в течение 4 ч в два приема, отфильтровывают, промывают водой, заливают 0.1 М раствором хлоридрата гидроксиламина и выдерживают 12 ч. Отделяют сорбент, промывают водой и заливают физиологическим раствором.

Содержание B 0.37-0.45%
Пример 2 (использование полученного сорбента).

Сорбент, полученный по примеру 1, был использован в аффинной хроматографии для определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека.

В колонку, снабженную фильтром, загружают 1 мл полученного сорбента и уравновешивают 5 мл ацетатного буфера, вводят 20 мл стандартной пробы, содержащей 17.2% GHb и 12.7% HbA₁C, промывают 15 мл ацетатного буфера и определяют оптическую плотность раствора при 405 нм (фракция Ghb). Затем вводят 5 мл раствора сорбитола, собирают элюат и определяют оптическую плотность при 405 нм (фракция HbA₁C). По поглощению растворов при 405 нм определяют содержание GHb и HdA_cC, которая при пересчете оказалась равной начальной концентрации в стандартном исходном растворе. Колонку далее регенерируют 10 мл 1% уксусной кислоты и 10 мл H₂O, и она вновь готова к работе.

На одной колонке проведено 20 определений. Получены воспроизводимые результаты с отклонениями + 5%
Таким образом, предложенный сорбент обладает высокой емкостью и стабильностью. Сорбент может быть с высокой степенью достоверности многократно использован для определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека.

Использование: изобретение относится к способам получения аффинных сорбентов и их использованию для определения глюкозилированного гемоглобина. Сущность: сорбент представляет собой сшитый глутаровым альдегидом поливиниловый спирт и иммобилизованный аминофенилборной кислотой при pH 7.4±0,5 до содержания связанного бора 0,37-0,45 мас.%. Предложены условия получения указанного сорбента. 2 с. и 3 з. п. ф-лы.

1. Сорбент на основе поливинилового спирта, стабилизированного глутаровым альдегидом с иммобилизированной аминофенилборной кислотой для определения гликозилированного гемоглобина, отличающийся тем, что он иммобилизован аминофенилборной кислотой при pH, равном 7,4 ± 0,5, до содержания связанного бора 0,37 0,45 мас. 2. Способ получения сорбента для определения гликозилированного гемоглобина, включающий стабилизацию поливинилового спирта водным раствором глутарового альдегида, вызревание геля, промывку, обработку полученного носителя аминофенилборной кислотой, выдержку, добавление боргидрида натрия и отделение сорбента, отличающийся тем, что стабилизацию осуществляют вначале смешивая 8 12% -ный раствор поливинилового спирта с 24 26%-ным раствором глутарового диальдегида при их объемном соотношении (4,5 5,5) 1, после чего добавляют концентрированную соляную кислоту до pH, равного 1,0 ± 0,1, обработку аминофенилборной кислотой проводят в растворе фосфатного буфера с pH, равным 7,4 ± 0,5, промывку ведут водой, после чего добавляют раствор хлоргидратгидроксиламина и сорбент выдерживают, при этом процесс ведут до содержания связанного бора в сорбенте 0,37 0,45 мас. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что после обработки носителя аминофенилборной кислотой выдержку ведут в течение 10 14 ч. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что добавление боргидрида натрия ведут в течение 4 ч в два приема равными порциями. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что после добавления раствора хлоргидратгидроксиламина сорбент выдерживают в течение 10 14 ч.