ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА Российский патент 1997 года по МПК B01D15/08 A61K38/00 

Изобретение относится к области хроматографического разделения веществ, в частности к хроматографическому выделению альфа-фетопротеина из биологических материалов.

Известен способ выделения альфа-фетопротеина (АФП) из биологических материалов, включающий трехступенчатую колоночную хроматографию, вначале на иммуносорбенте иммобилизованном овечьими антителами против альфа-фетопротеина человека, затем на голубой сефарозе, и затем на Con-A-сефарозе. Выход альфа-фетопротеина (АФП) по известному способу составляет около 20% при степени чистоты АФП около 96% (D.Chudy, V.Zizkovsky, Asimple and napid method for the isolation of human alpha-fetoprotein from human cord serum, Neoplasma, v. 34, 4, 1987, 491-495).

Недостатком известного способа является невысокий выход и недостаточная чистота целевого продукта.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения альфа-фетопротеина из абортивного материала, включающий обработку материала бутиловым спиртом с получением супернатанта, его диализ против фосфатного буфера, аффинную хроматографию на иммобилизованной диэтилстильбестероном сефарозе и элюированием АФП смесью бутилового спирта с хлоридом натрия (авт. св. СССР N 583536, кл. A 61 K 38/00, 1979)
Недостаток способа невысокая чистота целевого продукта (около 95%).

Задача настоящего изобретения разработка хроматографического способа выделения альфа-фетопротеина высокой степени чистоты с удовлетворительным выходом.

Поставленная задача решается хроматографическим способом выделения альфа-фетопротеина, включающий обработку биологического фетального материала раствором хлорида лантана с получением супернатанта, его диализ против фосфатного буфера, аффинную хроматографию, предпочтительно на голубой сефарозе, адсорбционную очистку, предпочтительно на оксиде алюминия, иммуноаффинную хроматографию в две стадии, на первой на иммуносорбенте иммобилизованном моноспецифическими к альфа-фетопротеину антителами животных с элюацией АФП раствором карбоната натрия, на второй с использованием иммуносорбента иммобилизованного кроличными полиспецифическими к балластным белкам антителами животных, диализ раствора после второй стадии и лиофилизацию.

В качестве носителя иммуносорбентов рекомендовано использовать сефарозу, активированную бромцианом.

В качестве исходного фетального биологического материала можно использовать абортальную сыворотку, пуповинную кровь, плацентарную сыворотку.

В качестве антител животных антитела кроликов, овец, коз, мышей.

Сущность предложенного способа заключается в том, что заявленная последовательность стадий и используемые сорбенты позволяют получить высокочистый препарат АФП.

В таблице приводится схема получения АФП с указанием чистоты и выхода продукта по стадиям.

Пример осуществления способа. К девяти объемам абортальной сыворотки добавляют при перемешивании 1 объем 10% LaCl₃•6H₂O, смесь выдерживают 3 ч в рефрижераторе при 4^oC. Центрифугируют при 6000 g в течение 20 мин. Полученный осадок 5 раз промывают 10-кратным объемом H₂O дист. при перемешивании с последующим центрифугированием. Промытый осадок растворяют в 0,2 М растворе двузамещенного фосфата натрия, а одновременно образующийся осадок кислого фосфорнокислого лантана La₂(HPO₄)₃ удаляют центрифугированием (6000 g, 15 мин). Полученный таким образом супернатант подвергали 2-х суточному диализу против 0,05 М фосфатного буфера (pH 7,3). После этого диализат пропускали через колонку, в которой в качестве афинного адсорбента балластных примесей (в основном сывороточного альбумина) использовалась голубая сефароза. Эту процедуру проводили под контролем иммунодиффузионного анализа в агаре с применением стандартных моноспецифических тест-систем по практически полной элиминации из диализата сывороточного альбумина. Полученный продукт подвергали адсорбционной хроматографии в объеме на Al₂O₃ L 5/4 в объемном соотношении 3: 1 в расчете на влажный сорбент. После одночасовой инкубации "в объеме" Al₂O₃ отделяли центрифугированием при 6000 g в течение 20 минут. Полученная таким образом конечная фракция представляла собой "полуочищенный" препарат АФП с чистотой 60% а выход целевого продукта составлял 30% (содержание АФП определялось с помощью стандартной моноспецифической тест-системы с чувствительностью 5 мкг/мл, а содержание общего белка определялось по методу Лоури). Результаты иммунодиффузионного анализа показали, что АФП, выделенный по приведенной схеме, полностью сохранил свои нативные антигенные свойства.

Иммуносорбент иммобилизованный кроличными моноспецифичными к АФП антителами получают следующим способом. Сефарозу 4D активированную бромцианом замачивают на 30 мин в 10 N растворе HCl, промывают водой, суспендируют в 0,1 N растворе NaHCO₃ с 0,5 М NaCl, инкубируют с "полуочищенным" АФП при 4^oC в течение 16 ч при осторожном перемешивании из расчета 10 мг белка на 1 мл геля. Проводят промывку тем же раствором, блокируют свободные реакционные группы раствором 1 М этаноламина с pH 8,0 в течение 2 ч. Отмывают 0,1 М NaHCO₃ с 0,5 М NaCl. Трижды отмывают нековалентно связанный белок вначале ацетатным буфером (pH 4,0), затем боратным буфером (pH 8,0) и заливают буфером 0,1 М NaHCO₃ + 0,5 M NaCl. Емкость полученного сорбента составила 1,5 мг антител на 1 мл антигенного сорбента.

Затем моноспецифическую антисыворотку к АФП, полученную путем иммунизации кроликов "полуочищенным" АФП с концентрацией антител 0,4 мг/мл пропускают через колонку с приготовленным иммуносорбентом в соотношении 350 мл антисыворотки на 10 см сорбента со скоростью 6 мл/мин. Промывают 2 М раствором NaCl с 0,05 М двузамещенным фосфатом натрия и водой. Элюируют 2% раствором Na₂CO₃ pH 11,4, и нейтрализуют элюат. Емкость полученного антительного иммуносорбента составила 0,5 мг белка на 1 мл сорбента.

На полученный, так называемый, "позитивный" иммуносорбент наносят полученный на предыдущих стадиях полупродукт, при этом иммуносорбент используют в режиме "воронки", т.е. получают единый элюат.

Сорбент промывают раствором 2 М NaCl+0,05 M Na₂HPO₄ и водой. Затем проводят элюирование 0,2 М раствором Na₂CO₃. Объем элюента равен количеству нанесенного сырья. Объем промывного раствора равен 10 объемам иммуносорбента.

Полученный элюат нейтрализуют 0,1 М раствором HCl до pH 7,3. Далее в элюат добавляют NaCl до 1 М и наносят его на "негативный" иммуносорбент, представляющий собой иммобилизованные иммуноаффинно выделенные полиспецифические "антидонорские" антитела на матрице цианбромированной сефарозы. Сырьем для выделения таких антител служила смесь 10-15 индивидуальных высокотитражных кроличьих антисывороток к плазме доноров. Антитела выделялись на антигенном иммуносорбенте, в котором лиганд представлен плазмопротеинами доноров.

При пропускании через колонку получают высокоочищенный АФП со степенью чистоты 98,6% Раствор диализуют против 0,1 М бикарбонатного буфера (pH 7,6) и лиофилизуют. "Негативный" иммуносорбент регерируют путем элюации связывающихся балластных белков 0,2 М Na₂CO₃ и промывают фосфатным буфером.

В результате получен альфа-фетопротеин чистотой 98,6% с выходом из исходного сырья около 30%
Таким же образом альфа-фетопротеин выделен из пуповинной крови и плацентарной сыворотки. Выход составил также около 30% а чистота препарата - до 99%

Использование: в хроматографическом выделении альфа-фетопротеина из биологических материалов. Сущность: фетальный биологический материал обрабатывают хлоридом лантана, диализуют против фосфатного буфера, хроматографируют на голубой сефарозе, очищают на Al₂O₃ и проводят двухстадийную аффинную хроматографию "полуочищенного" препарата на антительных иммуносорбентах, вначале на "позитивном" - сефарозе иммобилизованной моноспецифическими к АФП антителами, а затем на "негативном" - сефарозе иммобилизованной полиспецифическими к балластным белкам антителами. Получают высокочистый альфа-фетопротеин с соблюдением критериев биологической безопасности для человека. 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина, включающий реагентную обработку биологического фетального материала с получением супернатанта, его диализ против фосфатного буфера, аффинную хроматографию диализата с последующим элюированием альфа-фетопротеина, отличающийся тем, что в качестве реагента для обработки материала используют раствор хлорида лантана, полученный элюат подвергают адсорбционной очистке и затем иммуноаффинной хроматографии в две стадии, с использованием на первой стадии иммуносорбента, иммобилизованного специфическими к альфа-фетопротеину антителами животных, а на второй стадии иммуносорбента, иммобилизованного полиспецифическими к балластным белкам антителами животных, при этом иммуносорбент с первой стадии элюируют раствором карбоната натрия, а раствор после второй стадии иммуноаффинной хроматографии подвергают диализу и лиофилизации. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят на голубой сефарозе. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что адсорбционную очистку проводят на оксиде алюминия. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммуноаффинную хроматографию проводят с использованием в качестве носителя иммуносорбентов сефарозы, активированной бромцианом. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологического фетального материала используют абортальную сыворотку, пуповинную кровь, плацентарную сыворотку. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антител животных используют антитела кроликов, овец, коз, мышей.