Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений Советский патент 1993 года по МПК C08L29/14 

на 1 мл 10%-ного раствора ПВС в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей сшивкой полученного продукта за счет протекания реакции ацетилирования остаточных гидроксильных групп ПВС, составляющих около 95% от их исходного количества, образовавшимися альдегидными группами при рН 1, 37° С в течение 48 ч, в течение которых формируется гель необходимой пористости. Полученный блок затем размельчается и подвергается дополнительному упрочнению и активации. Это достигается обработкой гомогенизированного измельченного геля 5%-м раствором глутарового альдегида при рН 1, 37° С, при объемном соотношении гомогенизированного геля и 5%-ного раствора альдегида 1:1. При этом глутаровый альдегид ацетилирует оставшиеся гидроксильные группы. Для иммобилизации же аминосодержащих соединений используются как альдегидные группы ПВС-альдегида, не-вступившие в реакцию при формировании геля, так и альдегидные группы, введенные за счет ацетилирования носителя глутаровым альдегидом.

Полученный этим способом носитель обладает хорошими колоночными свойствами, не разрушается при действии крайних значений рН, органических растворителей, детергентов, ферментов микроорганизмов, выдерживает кипение. В ходе изготовления носителя происходит его стерилизация. Высокая плотность альдегидных групп /80 мкмоль/мл/, наряду с развитой поверхностью, обеспечивает возможность изготовления на основе предлагаемого носителя сорбентов с высокой емкостью.

Пример (прототип). К 200 мл 5%-ного крахмала, окисленного периодатом натрия из расчета 7 мг периодата на 1 мл раствора при комнатной температуре в течение 30 мин, добавляют 40 мл карбонатного буфера рН 10,5, 2М. Полученный раствор медленно вливают в энергично размешиваемый 10% раствор метилендианилина в метаноле /400 мл/. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 3 дня. Нерастворимые частицы сшитого полимера промывают на воронке Бюхнера метанолом, суспендируют в воде и восстанавливают боргидридом натрия из расчета 40 г на полученное количество носителя в течение 18 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь нейтрализуют уксусной кислотой, гель промывают водой и метанолом /по 300 мл/ и высушивают на воздухе.

100мг высушенного носителя суспендируют в 8 мл 50%-ной уксусной кислоты и перемешивают 1 ч. Водный раствор нитрита натрия /20 мг/мл/ добавляют по каплям к

полученной суспензии при охлаждении, смесь перемешивают 1 час при 0° С и затем доводят рН до 8,5 5Н едким натром. Нерастворимый полимер промывают 0,2 М фосфатным буфером рН 7,8 на воронке Бюхнера и суспендируют в 6 мл того же буфера, затем постепенно добавляют 10 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, Смесь пере0 мешивают в течение ночи при 4° С и промывают на воронке Бюхнера 200 мл 1М хлорида калия, 100 мл дистиллированной воды и суспендируют в забуференном 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2 физиологиче5 ском растворе (ЗФР). Затем проводят аффинное выделение человеческого иммуноглобулина из сыворотки в колонке. С

1 мл носителя элюировано в среднем 8,5 мг иммуноглобулинов. Максимальная скорость

0 тока колонки падает в 2 раза в течение часа. П р и м е р 2. 100 мл 10%-ного раствора ПВС окисляют периодатом натрия, добавляя при постоянном помешивании 700 мг периодата натрия и выдерживают при ком5 натной температуре 30 мин. Окисление проходит в течение первых минут процесса, при этом вязкость достигается 4,41-4,28 м2/с и в дальнейшем с увеличением времени окисления практически не меняется. Затем рН

0 доводят соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37° С. Полученный блок разбивают при помощи ножевого гомогенизатора , промывают на воронке Бюхнера 400 мл дистиллированной воды и

5 суспендируют 200 мл 5 глутарового альдегида, доводят рН концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37°С. При этом объемное соотношение гомогенизированного геля и 5%-ного раствора глута0 рового альдегида составляет 1:1. Если расчитывать это объемное соотношение на гель в форме блока, то оно равно 1:2. При гомогенизации объем геля увеличивается в

2 раза и это приводит к изменению соотно- 5 шения, причем объем гомогенизированного геля может незначительно варьироваться. 3 мл полученного носителя отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды по Шиффу, а затем 0 карбонатным буфером рН 8,5 0,1 М. К 3 мл отмытого носителя добавляют 3 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, выдерживают в течение ночи при 4° С, закрывают 5 непрореагировавшие альдегидные группы 0,1М моноэтаноламином при рН 8,0 в течение 4 ч при 22° С, восстанавливают основания Шиффа боргидридом натрия /1 мг/мл/ в течение 4 ч при комнатной температуре, отмывают ЗФР и загружают в колонку для

проведения аффинного выделения иммуноглобулинов человека. С 1 мл носителя элюировано в среднем 9 мг иммуноглобули- нов. Максимальная скорость тока колонки с диаметром 20 мм и объемом носителя 3 мл оставалась неизменной в течение 5 циклов аффинного выделения /10 ч/.

П р и м е р 3. 100 мл 10%-ного раствора ПВС окисляют периодатом натрия, добавляя при постоянном перемешивании 500 мг периодата, выдерживают при комнатной температуре 30 мин. При этом достигается вязкость 5,25-5,18 м2/с, после чего доводят рН концентрированной соляной кислотой до рН1 и выдерживают при 37° С 48 ч. Полученный блок разбавляют ножевым гомогенизатором, промывают на воронке Бюхнера 400 мл дистиллированной воды и суспенди- руют в 200 мл 5% глутарового альдегида, доводят рН концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37° С. Полученный носитель отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды по Шиффу, карбонатным буфером рН 8,5, 0,1 М, К 3 мл отмытого носителя добавляют 3 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, выдерживают з течение ночи при 4° С, закрывают непрореагировавшие альдегидные группы 0,1 М моноэтаноламином при рН 8,0 в течение 4 ч при комнатной температуре, восстанавливают основания Шиффа боргидридом натрия в концентрации 1 мг на миллилитр при комнатной температуре вте- чение 4 ч, отмывают ЭФР и загружают в колонку для проведения аффинного выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека, С 1 мл носителя элюировано в среднем 8,5 мг иммуноглобулина, что достоверно не отличается от количества иммуноглобулинов, полученного в примере 2. Изменения максимальной скорости тока колонки в течение 5 циклов аффинного выделения (10 ч) не наблюдались.

П р и м е р 4 /контрольный/. К 100 мл 10%-ного раствора ПВС добавляют при перемешивании 700 мг периодата натрия и выдерживают при комнатной температуре 30 минут. Затем рН доводят концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 20 ч при 37° С. Дальнейшие стадии проводят как в примере 2. С 1 мл полученного сорбента элюировано в среднем 1,5 мг иммуноглобулинов. Снижение емкости произошло, очевидно, из-за уменьшения активной поверхности носителя в результате формирования геля с более мелкими порами. Ухудшение колоночных свойств не зафиксировано.

П р и м е р 5 (контрольный). Формирование геля проводят по примеру 2. К измельченному и промытому гелю добавляют 200 мл 5%-ного раствора глутарового альдегида, доводят рН до 1 концентрированной соляной кислотой и выдерживают 24 ч при 37° С.

Последующие операции проводят аналогично тому, как это делалось в примере 2. Среднее значение емкости полученного сорбента составило 5 мг иммуноглобулина с 1 мл сорбента.

Таким образом из приведенных примеров следует, что оптимальным условием получения носителя по предлагаемому способу является формирование геля на основе

окисленного периодатом натрия 10%-ного раствора поливинилового спирта путем его выдержки при рН 1, 37° С в течение 48 ч с последующей гомогенизацией геля измельчением и обработкой при налогичных условиях 5%-ным раствором глутарового альдегида при равном объемном соотношении. В результате такой обработки происходит повышение эффективности (улучшение колоночных свойств) и повышение работоспособности носителя, что, очевидно, обуславливается формированием геля необходимой пористости и емкости для сорбции соответствующих аминосодержащих соединений, а также его упрочнение за счет

дополнительной сшивки глутаровым альдегидом.

Формула изобретения

Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений, включающий окисление периодатом карбо- цепного гидроксилсодержащего полимера и формирование геля на основе продукта окисления, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и увеличения работоспособности носителя, в качестве гидроксилсодержащего полимера используют 10%-ный раствор поливинилового спирта, окисление периодатом натрия производят из расчета 5-7 мг периодата на 1 мл водного раствора поливинилового спирта, последующее формирование геля осуществляют путем выдержки окисленного полимера при , температуре 37° в течение 48 ч до получения геля в форме блока с последующей гомогенизацией геля измель71789532 8

чением и обработкой при . температу-ношении гомогенизированного геля и 5%ре 37° С в течение 48 ч 5%-ным растворомного раствора глутарового альдегида, равглутарового альдегида при объемном соот-ном 1:1.