СПОСОБ "СКРИН-АЛАТ-ТЕСТ" ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно предназначено для скринингового определения активности аланин-амотрансферазы (АлАТ) в сыворотке или плазме крови в терапевтических и инфекционных стационарах, а также в учреждениях службы крови.

Аминотрансферазы катализируют межмолекулярный перенос аминогруппы между аминокислотами и кетокислотами. Наибольшее клинико-диагностическое значение имеют две аминотрансферазы: аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы.

Наиболее высокая активность аланин-аминотрансферазы выявлена в печени, поджелудочной железе, сердце, скелетной мускулатуре.

Согласно расчетным данным ВОЗ в разных странах мира только вирусными гепатитами инфицировано более одного миллиарда человек, поэтому ранняя диагностика является приоритетной задачей.

При гепатитах более информативным является определение активности АлАТ, степень повышения АсАТ обычно несколько меньшая.

Ценность энзимных тестов прежде всего контроля за АлАТ состоит в том, что он является, по существу, наиболее ранним критерием постановки синдромного диагноза острого гепатита на догоспитальном этапе, в частности в эпидоочагах.

Наиболее распространенной методике является определение активности аминотрансфераз унифицированным методом РайтманаФренкеля с использованием 2,4-динитрофенилгидразина, которая основана на учете разницы оптических плотностей окрашенных гидразинов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Интенсивность окрашивания измеряют колориметрически (1957 год).

Использование метода Райтмана-Френкеля в скрининговых исследованиях является неудобным по следующим причинам: длительность инкубации; соблюдение точности временных режимов и условий инкубации; сложность учета полученных результатов.

Известен микрометод качественного определения АлАТ по Райтману-Френкелю без стадии заключительного фотоколориметрирования с использованием контрольных сывороток для оценки активности АлАТ (см.Инструкцию по заготовке донорской крови от 3.08.84 N 06-14/10, утвержденной МЗ СССР).

Методика проведения следующая.

В каждую лунку гемаглютиационной пластинки на 72 лунки или в серологическую пробирку с помощью пастеровской пипетки вводят по 5 капель (0,125 мл) раствора субстрата (DL-альфа-аланин 0,2 моль/л, 2-оксоглутарат 2 ммоль/л и фосфатный буферный раствор рН 7,4 0,1 моль/л);
пластинку или пробирку инкубируют при 37^oС в течение 5 мин;
добавляют по 1 капле цельных исследуемых сывороток или плазмы;
в последние две лунки или пробирки вносят контрольные сыворотки;
содержимое аккуратно перемешивают и инкубируют при 37^oС в течение 30 мин;
добавляют по 5 капель раствора 2,4-динитрофенилгидразина 1 ммоль/л;
на 20 мин оставляют при комнатной температуре;
в каждую лунку (пробирку) добавляют по 1,25 мл 0,4 N или 0,5 мл 1N раствора NaOH;
содержимое перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин, после чего учитывают результаты.

Учет результатов начинают с контрольных образцов. Отрицательному результату соответствует слабое желто-коричневое окрашивание раствора, положительному коричневое, различной интенсивности.

Этот способ не позволяет проводить визуальную дифференцировку зон с нормальным уровнем значения активности АлАТ и "серой зоны". Кроме того, чувствительность этого способа значительно ниже самого метода Райтмана-Френкеля, в котором используется часовая инкубация.

Задачей изобретения является модификация известной методики, в которой исследуемую биологическую жидкость (плазму или сыворотку) и субстратно-буферную систему берут в равных соотношениях, при этом концентрация DL-альфа-аланина составляет 0,33 моль/л, 2-оксоглутарата 3,3 ммоль/л, кроме того, инкубирование смеси проводят не менее 15 мин.

Пример. Субстратно-буферную смесь (из расчета 1,5 мл на 1 планшет) выдерживают не менее 5 мин в термостате при 37^oС.

В 4 лунки полистиролового планшета вносят по 15 мкл физиологического раствора (контроль субстрата), в 4 другие лунки по 15 мкл контрольной сыворотки N 1 и в следующие 4 лунки по 15 мкл контрольной сыворотки N 2. В остальные лунки планшета закапывают по 15 мкл образцов исследуемых сывороток.

Во все лунки планшета вносят многоканальным дозатором по 15 мкл субстратно-буферной смеси (из термостата). Содержимое лунок тщательно перемешивают (осторожным постукиванием по краям планшета) и планшет выдерживают 20 мин в термостате при 37^oС.

По окончании инкубации во все лунки добавляют по 25 мкл реагента 2, содержимое лунок тщательно перемешивают и планшет оставляют на 20 мин при 22±2^oС.

Во все лунки вносят по 250 мкл раствора реагента 3, содержимое лунок тщательно перемешивают и через 5 мин оценивают результаты анализа.

Используемые реагенты:
Реагент 1 субстратно-буферная смесь для определения активности АлАТ 12 мл; DL-альфа-аланин 0,33 моль/л; 2-оксоглутарант 3,3 ммоль/л; буферный раствор рН 7,4.

Реагент 2 раствор 2,4-динитрофенилгидразина 1 ммоль/л в соляной кислоте (1 моль/л).

Реагент 3 раствор гидроокиси натрия 0,4 н.

Контрольная сыворотка N 1 сыворотка крови человека лиофилизированная с активностью АлАТ 0,48-0,68 ммоль/л • ч 1 (2) амп.

Контрольная сыворотка N 2 сыворотка крови человека лиофилизированная с активностью АлАТ 1,02-1,26 ммоль/л • ч 1 (2) амп.

Учет результатов основан на сравнении интенсивности окрашивания исследуемых сывороток с контрольными сыворотками. Сравнение производят визуально или на фоторегистрирующем устройстве для планшетов при длине волны 402 нм.

По интенсивности окрашивания растворов в лунках все исследуемые сыворотки делятся на 3 группы.

К первой относят сыворотки, интенсивность окрашивания которых не выше контрольной сыворотки N 1. Эти сыворотки имеют значения активности АлАТ не более 0,68 ммоль/л • ч, соответствующие ее нормальному уровню в сыворотке крови человека.

Ко второй группе относят сыворотки с интенсивностью окрашивания выше контрольной сыворотки N 1, но ниже контрольной сыворотки N 2. Активность АлАТ этих сывороток находится в диапазоне 0,69-1,0 ммоль/л • ч.

К третьей группе относят сыворотки, интенсивность окрашивания которых равна или выше контрольной сыворотки N 2. Активность АлАТ этих сывороток выше 1,0 ммоль/л • ч.

Перед началом исследования необходимо провести предварительный анализ активности АлАТ с использованием стрипа разборного планшета. При визуальной оценке результатов допустимо варьирование времени инкубации от 15 до 45 мин в зависимости от индивидуальных особенностей исследователя. Допустимыми является также сокращение времени реакции образования гидразонов с 2-4-динитрофенилгиразином до 15 мин.

Набор обеспечивает линейность при определении пирувата в инкубационной смеси в диапазоне концентраций от 1,0 до 21 мкмоль/л, что позволяет определять активность фермента до 70 МЕ/л (4,2 ммоль/л • ч).

Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 8%
Качество набора может быть проверено по контрольным сывороткам, аттестованным данным методом.

Пределы нормальных колебаний значений активности АлАТ для сыворотки крови человека 1,8-11,4 МЕ/л (0,11-0,69 ммоль/л • ч).

Данный способ определения активности АлАТ в сыворотке и плазме крови был апробирован широко (на несколько тысячах доноров) и на станции переливания крови Нижнего Новгорода.

Предложенный способ дает возможность оценить результаты исследования и в количественном выражении, что отсутствует в прототипе. Следует также отметить, что в случае получения сомнительных результатов в прототипе, приходится проводить дополнительные определения колориметрическим методом Райтнера-Френкеля, что не требуется при использовании предложенной методики.

Данный "СКРИН-АлАТ-ТЕСТ" показал высокую эффективность, четкость определения, удобство в работе с возможностью использования полистироловых 96-луночных планшетов, с помощью которых можно одновременно исследовать до 80-ти сывороток за более короткое время по сравнению с прототипами.

Использование: в медицине, а именно предназначено для скринингового определения аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке или плазме крови в терапевтических и инфекционных стационарах, а также в учреждениях службы крови. Сущность изобретения: исследуемую биологическую жидкость (плазму или сыворотку крови) берут в равном соотношении с субстратно-буферной системой, включающей DL-альфа-аланин в концентрации 0:33 ммоль/л, 2-оксоглутарат в концентрации 3,3 ммоль/л и буферный раствор рН 7,4, инкубируют смесь при температуре 37^oС не менее 15 мин далее к смеси добавляют 1 ммоль/л раствора 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают при комнатной температуре не более 20 мин, затем в смесь вносят 0,4 Н раствор щелочи и выдерживают также при комнатной температуре не менее 5 мин. Активность фермента определяют путем сравнения интенсивности окрашивания растворов в образце и контроле. Способ позволяет получить высокую эффективность и четкость определения аланинаминотрансферазы.

Способ определения активности аланинаминотрансферазы в сыворотке (плазме) крови путем взаимодействия исследуемой биологической жидкости с субстратно буферной системой, включающей DL-альфа-аланин, 2-оксоглутарат и буферный раствор рН 7,4, с последующим инкубированием смеси при 37^oС, далее к смеси добавляют 1 ммоль/л раствор 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают при комнатной температуре не более 20 мин, затем в смесь вносят 0,4 Н раствор щелочи и выдерживают также при комнатной температуре не менее 5 мин, активность фермента определяют путем сравнения интенсивности окрашивания растворов в образце и контроле, отличающийся тем, что исследуемую биологическую жидкость и субстратно-буферную систему берут в равном соотношении, при этом концентрация DL-альфа-аланина составляет 0,33 моль/л и 2-оксоглутарата-3,3 ммоль/л, а инкубирование проводят не менее 15 мин.