ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К HBs-АНТИГЕНУ И БЛОКАТОР В ТЕСТ-СИСТЕМЕ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/576 C12N15/51 A61K39/29 

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и иммунологии и касается разработки иммуноферментной тест-системы для определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg).

Известна тест-система, предназначенная для выявления антител к HBsAg в сыворотке (плазме) крови человека. Тест-система "ВектоHBsAg - антитела-стрип". ЗАО "Вектор - Бест", Россия. Инструкция по применению. 03.04.2000 г.

Известная тест-система может быть использована для контроля за уровнем специфического иммунного ответа при вакцинации против гепатита В, представляет собой набор реагентов для выявления антител к HBs-антигену методом иммуноферментного анализа и рассчитана на проведение 96 анализов, включая контроли.

Состав набора:
стрипированный планшет с иммобилизованным HBsAg субтипов ad и ау - 1 шт;
контрольная положительная сыворотка (К⁺) - 1 фл., 1,3 мл;
контрольная отрицательная сыворотка (К^-) - 1 фл., 2,5 мл;
конъюгат (HBs-антиген, меченный пероксидазой хрена) - 1 фл., 1,3 мл;
концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (25-кратный) - 1 фл., 20 мл;
цитратно-фосфатный буфер - 1 фл., 12 мл;
тетраметилбензидин (концентрат) - 1 фл., 1 мл;
стоп-реагент - 1 фл., 6 мл.

В известной тест-системе положительный контроль представлен сывороткой крови животных, иммунизированных HBsAg. В таком случае наличие биологического материала несет опасность заражения, и подобный реагент можно отнести к тем, в работе с которыми требуется соблюдение мер предосторожности, при этом сыворотка крови животных может содержать и другие инфекционные агенты.

Тест-система предназначена только для выявления антител к HBs-антигену и не позволяет провести определение в образце их количественного содержания.

В качестве ближайшего аналога рассматривается известная тест-система для определения антител к поверхностному антигену возбудителя гепатита В.

"Monolisa anti - HBs 3.0". Код 72400. 96 тестов. Franch National Centre for Blood Transfusion, 2000.

Состав известного набора приведен в табл. 1.

При приготовлении известной тест-системы используется высокопатогенный материал - сыворотка крови людей, инфицированных вирусом гепатита В. При этом нет полной гарантии отсутствия возбудителей иных инфекционных агентов. Реагенты "человеческого" происхождения рассматриваются как потенциально инфицированные и в работе с ними необходимо соблюдать соответствующие меры предосторожности.

Задачей изобретения является создание тест-системы для определения антител к HBsAg, позволяющей с высокой эффективностью и безопасностью проводить качественный и количественный анализ в различных биологических образцах - сыворотке крови, плазме.

Технический результат изобретения заключается в повышении специфичности проводимых анализов с использованием разработанной тест-системы, что обеспечивается использованием реагентов, не являющихся заменителями биологических агентов, а также тем, что при работе с данной тест-системой достигается лучшее отмывание комплекса антиген-антитело от неспецифических компонентов исследуемого биологического образца.

Поставленная задача решена с помощью предлагаемой новой тест-системы.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Тест-система представляет собой набор реагентов, необходимых для качественного и количественного определения антител к поверхностному антигену возбудителя гепатита В методом ИФА в сыворотке крови или плазме.

В тест-систему дополнительно включен разработанный авторами изобретения реагент-блокатор (условное название), представляющий собой белково-солевой раствор.

Использование нового реагента при постановке ИФА обеспечивает уменьшение неспецифических реакций, что в конечном итоге повышает точность метода.

Тест-система рассчитана на проведение 96 анализов, включая контроли.

Состав набора
1. 1 микропланшет (12 стрипов по 8 лунок в рамке), сенсибилизированный дрожжевым рекомбинантным HBsAg серотипов ау и/или ad. Маркировка МП.

2. Промывающий раствор:
0,01 моль/л фосфатно-солевой буферный раствор рН 7,2±0,2 - 24 мл
Твин-20 - 1,25%
Мертиолят натрия (консервант) - 0,01%
1 флакон, содержит 24 мл.

Маркировка ФСБ-Т.

3. Блокатор - белково-солевой раствор, лиофильно высушенный:
Казеинат натрия - 0,25 г (5%)
Натрий-боратный буфер рН 8,3 - 5 мл
3 флакона.

Маркировка Б.

4. Отрицательный контрольный образец.

Отконтролирован на отсутствие HBs-антител.

Сыворотка крови человека, не содержащая антител к поверхностному антигену вирусу гепатита В - 7 мл
Азид натрия (консервант) - 0,1%
1 флакон, содержащий 7 мл. Маркировка К-.

5. Положительный контрольный образец.

Сыворотка крови доноров, иммунизированных рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В серотипов ау и/или ad - 0,2 мл
Азид натрия (консервант) - 0,1%
Маркировка К+.

Откалиброван в мМЕ/мл по международному стандарту анти-HBsAg
1 флакон, содержащий 0,2 мл, или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В ОСО 42-28-320-00.

Представляет собой белковый раствор иммунологически активной фракции иммуноглобулина, выделенной методом фракционирования этиловым спиртом при температуре ниже 0^oС из плазмы (сыворотки) крови доноров, иммунизированных вакциной гепатита В рекомбинантной дрожжевой жидкой. Стерильный иммуноглобулин содержит 50% раствор сахарозы с концентрацией в конечном продукте 2%. Лиофилизируют в ампулах.

Ампула 0,2 мл.

6. Биотин-HBsAg-коньюгат.

Дрожжевой рекомбинантный HBsAg серотипов ау и/или ad, меченный биотином - 0,6 мл
Бычий сывороточный альбумин - 1%
Мертиолят натрия (консервант) - 0,01%
1 флакон, содержащий 0,6 мл раствора. Маркировка Кт-1.

7. Конъюгат авидин-пероксидаза или стрептавидин-пероксидаза.

Пероксидаза, меченная авидином или стрептавидином - 0,6 мл
Бычий сывороточный альбумин - 1%
Мертиолят натрия (консервант) - 0,01%
1 флакон, содержащий 0,6 мл раствора.

Маркировка Кт-2.

8. Субстратный буфер.

Цитратно-фосфатный буферный раствор рН 5,2±0,2 - 39 мл
Перекись водорода - 0,033%
1 флакон, содержит 39 мл раствора. Маркировка СБ.

9. Хромоген.

Ортофенилендиамин (содержание ОФД в таблетке 6 мг). 1 флакон, содержит 3 таблетки. Маркировка ОФД.

10. Стоп-реагент.

5%-ный раствор серной кислоты.

1 флакон, содержит 12 мл.

Маркировка СР.

11. Референс-стандарт.

Представляет собой сыворотку крови, полученную иммунизацией здоровых (непереболевших) доноров рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В, оттитрованную по международному стандарту содержания анти-HBs.

1 флакон
или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В ОСО 42-28-320-00.

Ампула 0,2 мл.

Тест-система комплектуется реагентами в различных вариантах, что позволяет потребителю в зависимости от поставленной задачи использовать один из 3 предлагаемых наборов:
1. Тест-система содержит реагенты для определения антител к HBsAg серотипа ау.

2. Тест-система для определения антител к HBsAg серотипа ad.

3. Тест-система для определения антител к HBsAg серотипов ау и ad.

Тест-система не содержит в качестве реагентов какие-либо образцы, выделенные из крови инфицированных пациентов или животных, что обеспечивает полное устранение риска заражения при работе с данной тест-системой и не требует соблюдения особых мер предосторожности. Это обстоятельство делает систему удобной и безопасной в работе.

1. Приготовление иммуносорбента.

Рекомбинантный HBsAg, серотипов ау и/или ad, разведенный в стерильном 0,01 моль/л фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,2±7,4) до концентрации белка 1-2 мкг/мл, вносят в каждую лунку 96-луночного цельного или разборного полистиролового планшета фирмы "Costar" (США, кат. 92592) или аналогичного качества других фирм. Планшет герметично закрывают и выдерживают 18-20 часов при температуре 4-10^oС. После этого содержимое лунок удаляют сильным встряхиванием и промывают планшет трехкратно стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2±0,2), содержащим 0,5% Твина-20. Отмытый планшет помещают в пакет из полиэтиленовой пленки, закладывают осушитель и герметично запаивают.

Планшеты с иммобилизованным HBsAg хранят при температуре 4-10^oС.

2. Приготовление конъюгата (HBsAg-биотин).

2.1. Растворяют N-гидроксисукцинимидный эфир биотина в диметилсульфоксиде до концентрации белка 3 мг/мл.

2.2. Рекомбинантный HBsAg серотипов ау и/или ad растворяют в 0,1 моль/л карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 8,6 до концентрации белка 1 мг/мл и диализуют против нескольких смен этого буфера в течение 12 часов при температуре 4^oС.

2.3. Смешивают два раствора в объемном соотношении 1:10 (активированный биотин: рекомбинантный HBsAg) и инкубируют при температуре 20-22^oС в течение 4 часов.

2.4. Образовавшийся конъюгат HBsAg-биотин диализуют против нескольких смен 0,05 моль/л трис-HCl буферного раствора рН 7,4 при температуре 4-10 ^oС в течение 12 часов с целью удаления несвязавшегося производного биотина.

2.5. После снятия с диализа к конъюгату добавляют бычий сывороточный альбумин и мертиолят натрия до конечной концентрации в растворе соответственно 1 и 0,01%. Готовый конъюгат хранят при температуре 4-10^oС.

3. Приготовление конъюгата HBsAg-биотин-авидин-пероксидаза (или HBsAg-биoтин-cтpeптaвидин-пepoкcидaзa).

Готовят непосредственно перед использованием: к биотинилированному HBsAg добавляют конъюгат авидин-пероксидаза (стрептавидин-пероксидаза) в рабочих разведениях.

Конъюгат авидин-пероксидаза (стрептавидин-пероксидаза) - пероксидаза, меченная авидином (стрептавидином), - коммерческие препараты фирмы "Sigma" (кат. 3151, 9420) или аналогичного качества других фирм.

4. Приготовление положительного и отрицательного контрольного образца.

Для приготовления положительного контрольного образца используют сыворотки доноров, иммунизированных вакциной против гепатита В рекомбинантной дрожжевой жидкой. Для выявления антител к ad-субтипу вакцинируют рекомбинантной вакциной, содержащей ad-HBsAg. Положительный контрольный образец калибруют в мМЕ/мл относительно стандарта Всемирной Организации Здравоохранения.

Для приготовления отрицательного контрольного образца используют сыворотки доноров, не подвергавшихся иммунизации вакциной против гепатита В, не болевших гепатитом В, отконтролированные на отсутствие HBs-антител.

Все сыворотки, используемые для приготовления стандартных образцов, контролируют на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg).

5. Приготовление белково-солевого раствора (5%-ный раствор казеина в натрий-боратном буферном растворе (рН 8,3)). (Блокатор).

Приготовление раствора борной кислоты концентрацией 0,5 моль/л. Взвешивают 31 г борной кислоты (Н₃ВО₃), растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 литра.

Приготовление раствора гидроксида натрия концентрацией 0,5 моль/л. Взвешивают 20 г гидроксида натрия (NaOH), растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 литра.

Приготовление натрий-боратного буферного раствора (рН 8,3). К раствору борной кислоты добавляют раствор гидроксида натрия до достижения рН раствора 8,3.

Взвешивают 25 г казеина, переносят в коническую колбу вместимостью 500 мл и приливают 250 мл натрий-боратного буферного раствора. Колбу ставят на магнитную мешалку, раствор перемешивают в течение 30 мин, затем, продолжая перемешивать, колбу помещают в водяную баню и нагревают до 40^oС до полного растворения казеина. Раствор из конической колбы переводят в мерную колбу вместимостью 500 мл, охлаждают до 20^oС и доводят объем до 500 мл натрий-боратным буферным раствором.

Полученный раствор казеина разливают по 5 мл во флаконы вместимостью 15 мл, лиофильно высушивают и герметично закрывают. Белково-солевой раствор добавляется в ФСБ-Т с целью уменьшения неспецифических реакций при постановке ИФА.

6. Приготовление цитратно-фосфатного буферного раствора рН 5,0-5,5, содержащего 0,033% перекиси водорода (ЦФБР).

Сырье и материалы:
- вода дистиллированная - ФС-42-2619-97;
- кислота лимонная - ГОСТ 3652-89;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный - ГОСТ 4172-76;
- перекись водорода, 33% раствор - ГОСТ 177-88.

Описание технологического процесса:
Взвешивают 4,1 г лимонной кислоты (С₆Н₈O₇х3Н₂О) и 11,15 г натрия фосфорнокислого двузамещенного (Na₂HPO₄х3H₂O), растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л. К полученному раствору добавляют 1,0 мл 33%-ной перекиси водорода (Н₂О₂).

Цитратно-фосфатный буферный раствор с перекисью водорода разливают стеклянными градуированными пипетками по 39 мл во флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми колпачками.

Каждый флакон с ЦФБР полностью заворачивают в металлическую фольгу.

7. Хромоген.

Таблетки ОФД - ТУ 6-14-113-70-95.

8. Табл. 4 (таблица логарифмов) входит в инструкцию по применению тест-системы для выявления антител к поверхностному вирусу гепатита В.

9. Фосфатно-солевой буферный раствор:
- вода дистиллированная - ФС-42-2619-97;
- калий фосфорнокислый двузамещенный (К₂НРO₄х3Н₂О) - ГОСТ 2493-75;
- калий фосфорнокислый однозамещенный (КН₂РO₄) - ГОСТ 4198-75;
- натрия хлорид (NaCl) - ГОСТ 4233-77;
- Твин-20 - импортный ("Pharmacia", Швеция).

Приготовление 25-кратного концентрата фосфатно-солевого буферного раствора рН (7,2±0,2), содержащего 1,25% Твина-20 (ФСБ-Т).

Взвешивают 228 г калия фосфорнокислого двузамещенного (К₂НPO₄х3Н₂О), растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л. Взвешивают 136 г калия фосфорнокислого однозамещенного (КН₂РO₄), растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л. Смешивают 215 мл раствора К₂НРO₄х3Н₂O и 35 мл раствора КН₂РO₄, приготовленных как указано выше, добавляют 12,5 мл Твина-20 и доводят объем до 1 л дистиллированной водой. К полученному раствору добавляют 215,5 г хлорида натрия (NaCl).

Фосфатно-солевой буферный раствор с твином разливают стеклянными градуированными пипетками по 24 мл во флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми колпачками.

10. В качестве стандарта-калибратора для построения градуировочного графика используют положительный контрольный образец. График строят по результатам измерения ОП для пяти разведении К+, фиг.1.

Положительный контроль для ad-тест системы основан на ad Ig.

При приготовлении иммуносорбента для сенсибилизации можно применять, например, дрожжевой рекомбинантный HBsAg серотипа ау, полученный культивированием клеток штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203 (Патент РФ 2088664) или КБТ-98р НВ-50/ VKPM - Y2412. (ad) (ФСП 42-0029-1385-01). Эти же известные антигены используют и при получении конъюгата биотин-HBsAg.

В случае получения положительного контрольного образца и референс-стандарта используют, например, известную вакцину против гепатита В, содержащую эффективное количество (20 мкг) поверхностного антигена вируса гепатита В, полученного культивированием трансформированных клеток штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203, 0,5 мг геля гидроксида алюминия (в пересчете на Al), буфер ПБС (50 мМ Na-фосфатный, рН 6,8 + 0,13 М Nad), 0,005% мертиолят натрия.

Патент РФ 2088664.

Иммунизацию доноров проводят по известным схемам, разработанным для введения указанной вакцины, например, трехкратно в/м в дельтовидную мышцу.

Способ применения
В исследовании может быть использована сыворотка или плазма. Для исключения ложных результатов исследуемые образцы необходимо отбирать и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст.

Наличие преципитатов, тромбов, клеток крови может приводить к ложноположительным результатам. Поэтому нерастворимые частицы должны быть удалены перед постановкой реакции путем центрифугирования. Хилезная сыворотка может обуславливать ложнонегативные результаты. Поэтому липиды должны быть удалены перед постановкой реакции путем центрифугирования.

Исследуемые образцы сыворотки (плазмы) крови человека хранят при температуре (6±2)^oС не более 24 часов. Более длительное хранение допускается при температуре не выше -20^oС с исключением многократного оттаивания - замораживания (не более 1 раза).

Образцы с выраженным гемолизом, сильно опалесцирующие или контаминированные анализу не подлежат.

Подготовка реагентов
Все компоненты, используемые при постановке реакции, необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22±2)^oС.

Приготовление раствора для промывания планшетов и разведения конъюгата (раствор 1).

Отмерить необходимое количество концентрата ФСБ-Т, развести в 25 раз дистиллированной водой. Тщательно перемешать.

В концентрате ФСБ-Т после хранения при температуре 2-8^oС может образовываться кристаллический осадок солей. В таком случае перед разведением ФСБ-Т необходимо нагреть его при температуре (37±1)^oС до полного растворения осадка.

Содержимое флакона с блокатором растворить в 5,0 мл приготовленного ФСБ-Т. Полученный раствор добавить в емкость с раствором ФСБ-Т (согласно табл. 2) и тщательно перемешать.

Приготовление раствора для разведения К+ и исследуемых образцов (раствор 2).

Отмерить необходимое количество отрицательного контрольного образца (К-) и развести его раствором 1 в 10 раз. Тщательно перемешать.

Приготовление контрольных образцов (К+ и К-).

К- готов к использованию и не требует дополнительного разведения.

Положительный контрольный образец развести в чистом стеклянном флаконе раствором 2 до содержания 100 мМЕ/мл антител к поверхностному вирусу гепатита В. Например, если титр К+ 2000 мМЕ/мл, то первое разведение должно быть 1: 20. Последующие двукратные разведения (1:40, 1:80 и т.д.) соответственно содержат 50; 25; 12,5; 6,25 мМЕ/мл.

Приготовление раствора конъюгата.

Готовить непосредственно перед употреблением. Отмерить в чистый стеклянный флакон 4,8 мл раствора 1, смешать с 0,2 мл Кт-1. Отмерить в другой флакон 4,8 мл раствора 1, смешать с 0,2 мл Кт-2. К раствору Кт-1 добавить раствор Кт-2, тщательно перемешать. Приготовленный раствор хранению не подлежит.

Приготовление раствора ОФД.

Готовить непосредственно перед употреблением в защищенном от света месте. Растворить 1 таблетку ОФД в 13 мл субстратного буфера, тщательно перемешать (до полного растворения таблетки). Приготовленный раствор хранению не подлежит.

Проведение иммуноферментного анализа
Промывка. Перед использованием планшет промыть трехкратно раствором 1, внося в каждую лунку планшета по 0,3 мл раствора. По окончании промывки из лунок планшета необходимо тщательно удалить влагу, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. Не допускать высыхание планшета между отдельными операциями при постановке реакции.

Внесение контрольных и исследуемых образцов. Разведения положительного контрольного образца (К+) внести по 0,1 мл в лунки: С1 - 100 мМЕ/мл, D1 - 50 мМЕ/мл, Е1 - 25 мМЕ/мл, F1 - 12,5 мМЕ/мл, G1 - 6,25 мМЕ/мл.

Отрицательный контрольный образец (К-) внести по 0,1 мл в лунки А1 и В1.

Для контроля конъюгата в лунку HI внести 0,1 мл раствора 1 ("бланк").

Исследуемые образцы сывороток (плазмы) крови цельные или в разведениях (разводить раствором 2 на отдельном планшете) внести по 0,1 мл в остальные лунки планшета (А2, В2, С2 и т.д.).

Планшет герметично закрыть и инкубировать в течение (60±5) минут при температуре (37±1)^oС.

По окончании инкубации содержимое лунок собрать в сосуд с дезинфицирующим раствором, планшет промыть 5 раз раствором 1 и удалить влагу, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Внесение конъюгата. В каждую лунку планшета, кроме H1 ("бланк"), внести по 0,1 мл конъюгата. Планшет герметично закрыть и инкубировать в течение (60±5) минут при температуре (37±1)^oС.

По окончании инкубации содержимое лунок собрать в сосуд с дезинфицирующим раствором, планшет промыть 5 раз раствором 1 и удалить остатки влаги, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Внесение раствора ОФД. Внести в каждую лунку планшета по 0,2 мл раствора ОФД.

Планшет выдержать при температуре (20±2)^oС в течение 30 мин в защищенном от света месте.

Внесение стоп-реагента. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 0,1 мл стоп-реагента (СР) и немедленно измеряют оптическую плотность (ОП).

Регистрация и оценка результатов
Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 492 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень ("бланк") осуществляют по лунке планшета H1. Результаты исследований оценивают в том случае, если среднее значение ОП в лунках с К- не более 0,1, а значение ОП в лунке с К+ 100 мМЕ/мл не менее 0,80 оптических единиц.

Исследуемый образец расценивают как положительный, если соответствующее ему значение ОП превышает критическое значение ОП (ОП_крит), которое вычисляют по формуле
ОП_крит = ОП К-_ср + 0,05,
где ОП К-_ср - среднее значение ОП К-.

Определение уровня специфических антител в положительных образцах сывороток проводят по градуировочному графику, построенному в координатах: у - lg ОП К+, х - log₂ кратности его разведения (см. график) фиг.1. График строят по результатам измерения ОП для пяти разведений К+.

Зная ОП исследуемого образца (например, 0,371 - неразведенный), находят lg этого числа (lg 0,371 = -0,43) и через точку на оси ординат, соответствующую его значению (-0,43), проводят прямую, параллельную оси абсцисс. Через точку пересечения прямой и линейного участка графика опускают перпендикуляр на ось абсцисс и определяют log₂ кратности разведения положительного контрольного образца (Х = 2,8), соответствующий значению ОП данного разведения исследуемого образца.

Затем по табл. 3 находят кратность разведения контрольного положительного образца, соответствующую этому логарифму (А = 6,96).

После этого проводят расчет титра антител в исследуемом образце по формуле

где Т - титр исследуемого образца, мМЕ/мл; T₁ - титр положительного контрольного образца, откалиброванного в мМЕ/мл по международному стандарту анти-HBs; А - кратность разведения положительного контрольного образца, найденная по табл. 3; A х 10 - разведение положительного контрольного образца; В - разведение исследуемой сыворотки, в котором определялась оптическая плотность.

Пример расчета (табл. 4): если титр положительного контрольного образца равен 2000 мМЕ мл, то титр исследуемой сыворотки в нашем примере

Предлагаемая тест-система выявляет анти-HBs в сыворотке крови с чувствительностью не менее 10 мМЕ/мл.

Характеристики разработанной тест-системы определялись с использованием случайных проб сывороток, проб от привитых лиц, проб от больных вирусным гепатитом В, сывороток вакцинированных животных и иммуноглобулина против гепатита В. Определяли уровень анти-HBs с помощью разработанной тест-системы и наборов фирмы "Abbott" и "Monolisa".

Качественный и количественный анализ был выполнен на 322 положительных образцах: 155 привитых людей, 42 больных вирусным гепатитом В, 114 сывороток вакцинированных животных (белых мышей и морских свинок), 11 серий иммуноглобулина против гепатита В.

Установлена сопоставимость результатов определения анти-HBs с помощью разработанной тест-системы и тест-наборов фирм "Abbott" и "Monolisa": коэффициент корреляции соответственно составил 0,90-0,95.

Специфичность тест-набора, оцененная на популяции из 553 неотобранных доноров крови, составила 99,9%.

Анализ 34 проб пациентов с патологией, неродственной гепатиту В, не позволил установить наличия неспецифических реакций.

Разработанная тест-система может быть использована для:
- определения иммунного статуса населения пред вакцинацией и оценки эффективности вакцинации;
- определения тяжести течения и прогноза заболевания;
- отбора плазмы доноров с высоким содержанием антител к HBsAg для производства специфического иммуноглобулина;
- определения концентрации антител к вирусу гепатита В в препарате специфического иммуноглобулина;
- для оценки иммуногенности вакцин на животных.

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для определения в различных биологических образцах антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Сущность изобретения состоит в том, что для определения антител к HBsAg используют тест-систему, содержащую стрипированный планшет, сенсибилизированный дрожжевым рекомбинантным HBsAg серотипов ау и/или ad, промывающий раствор, конъюгат биотин-HBsAg, конъюгат авидин-пероксидазу или стрептавидин-пероксидазу, субстратный буфер с перекисью водорода, хромоген, стоп-реагент, отрицательный контроль, положительный контроль в виде сыворотки крови, полученной иммунизацией здоровых доноров рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В, оттитрованной по международному стандарту содержания анти-HBs, или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В, блокатор, в виде 5%-ного раствора казеината натрия в натрий-боратном буфере с рН 8,3, референс-стандарт для количественного определения антител к HBs-антигену в виде сыворотки крови, полученной иммунизацией здоровых доноров рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В, оттитрованной по международному стандарту содержания анти-HBs, или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В и таблицу логарифмов для расчета количественного содержания антител к HBs-антигену. Преимущество состоит в том, что система обеспечивает повышение специфичности проводимых анализов и их безопасность. 2 с.п.ф-лы, 4 табл., 1 ил.

1. Блокатор в тест-системе для определения анти-HBs в биологическом образце методом иммуноферментного анализа, содержащий казеинат натрия и натрий-боратный буфер лиофильно, высушенные при следующем соотношении компонентов:
Казеинат натрия - 0,25 г
Натрий-боратный буфер рН 8,3 - 5 мл
2. Тест-система для определения анти-HBs в биологическом образце методом иммуноферментного анализа, содержащая стрипированный планшет, сенсибилизированный HBsAg, промывающий раствор, конъюгат биотин-HBsAg, конъюгат стрептавидин-пероксидазу, субстратный буфер с перекисью водорода, хромоген, стоп-реагент, положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец, отличающаяся тем, что в качестве антигенов для сенсибилизации планшет и в конъюгате биотин-HBsAg используют дрожжевой рекомбинантный HBsAg серотипов ау и/или ad, а в качестве положительного контрольного образца используют сыворотку крови, полученную иммунизацией здоровых доноров рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В, оттитрованную по международному стандарту содержания анти-HBs, или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В, при этом тест-система дополнительно содержит блокатор по п.1, референс-стандарт для количественного определния антител к HBs-антигену в виде сыворотки крови, полученный иммунизацией здоровых доноров рекомбинантной дрожжевой вакциной против гепатита В, оттитрованной по международному стандарту содержания анти-HBs или отраслевой стандартный образец иммуноглобулина человека против вируса гепатита В и таблицу логарифмов для расчета количественного содержания антител к HBs-антигену.