НАБОР ДЛЯ РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/265 G01N33/569 G01N33/535 G01N33/543 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для широкомасштабной ретроспективной иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных.

Известен набор для диагностики инфекционного ринотрахеита животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), содержащий панели для постановки ИФА, антиген вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, антиИРТ сыворотку, контрольную сыворотку, антивидовой иммунопероксидазный коньюгат, калийфосфорнокислый однозамещенный, калийфосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, Твин-80, лимонную кислоту, ортофенилендиамин и перекись водорода (Технические условия 19.10.97-89 "Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 01.08.89). (Прототип) (1). Однако указанный набор имеет меньшую чувствительность, высокую себестоимость и требует большего времени для постановки реакции.

Целью заявляемого изобретения является повышение чувствительности, сокращение сроков постановки реакции и снижение себестоимости набора для ретроспективной иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных путем выявления специфических антиИРТ антител в сыворотках крови и другом клиническом материале. Указанная цель достигается тем, что в состав набора входят: 96 луночных микропланшет из полистирола, сенсибилизированных аффино очищенным антигеном вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2 (2), в количестве 0,075 - 0,125 мкг на лунку, антиИРТ (положительная) и нормальная (отрицательная) контрольные сыворотки, коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент (Твин-20, -80 или Тритон Х-305), 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент.

В состав набора входят следующие биологические и химические компоненты:
1. 96 луночные микропланшеты из полистирола, сенсибилизированные аффино очищенным антигеном вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, в количестве 0,075 - 0,125 мкг на лунку 2 шт.

2. АнтиИРТ (положительная) сыворотка крупного рогатого скота 1 амп. (фл. ), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.

3. Нормальная (отрицательная) сыворотка 1 амп. (фл.), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200.

4. Антивидовой иммунопероксидазный коньюгат лиофилизированный 1амп. (фл. ), объем 1 см³, рабочее разведение 1:20.

5. 20-кратный концентрат инкубационного буфера (0,2М калийфосфатный буфер, содержащий ЗМ натрия хлористого, рН 7,3) 1 фл. объем 50 см³.

6. Твин-20, -40, -80 или тритон Х-305, 1 фл. - 1 см³.

7. 10-кратный концентрат субстратного буфера (1,5М фосфатно нитратный буферный раствор, рН 5,0) 1 фл. объем 5 см³.

8. Ортофенилендиамин (ОФД), 1 фл. - 20 мг.

9. Гидроперит (перекись водорода), 1 табл. - 0,5 г.

10. Стоп-реагент 1М раствор серной кислоты 1 фл. объем 10 см³.

Приготовление компонентов набора.

1. Приготовление рабочих буферов
1.1. Инкубационный фосфатно-солевой твиновый буферный раствор предназначен для разведения контрольных, исследуемых сывороток и антивидового коньюгата, а также для промывки панелей. Содержимое флакона с 20-кратным калийфосфатным буфером доводят дистиллированной водой до 1000 см³ и растворяют в этом объеме 1 см³ Твина-20, -40, -80 или тритона Х-305. Инкубационный буфер представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4.

1.2. Субстратный цитратно фосфатный буферный раствор рН 5,0-5,2 готовят доведением содержимого флакона с 10-кратным цитратно фосфатным буфером до 50 см³ дистиллированной водой.

Раствор субстрата готовят не ранее, чем за 10 мин до внесения в лунки панелей. Для этого 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 2 см³ спирта-ректификата, добавляют 48 см³ субстратного буфера и вносят 0,8 см³ раствора перекиси водорода, полученного растворением таблетки гидроперита в 10 см³ дистиллированной воды. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет.

2. Приготовление антигена вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Известен способ получения антигена вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота для реакции ИФА (Технические условия 19.10.97-89 "Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 01.08.89), включающий репродукцию вируса ИРТ в культуре клеток ПТ-80, концентрирование вируссодержащей суспензии ультрафильтрацией, высокоскоростное ультрацентрифугирование, дезинтеграцию клеток ПТ-80 ультразвуком и осветление суспензии низкоскоростным центрифугированием. Однако известный способ трудоемок и позволяет получить антиген сильно загрязненный клеточными обломками, что сказывается на чувствительности реакции. В заявляемом наборе антиген вируса инфекционного ринотрахеита готовят следующим образом: для этого монослой клеток ПТ-80 после репродукции вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,01М калийфосфатном буфере, содержащем 0,15М натрия хлористого, 1% Тритона Х-100, рН 7,2-7,4. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком на аппарате типа УЗДН-21 мощностью 22 кГц импульсивно 6 раз по 30 секунд. После чего дезинтеграт центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 25-30 минут. Образовавшийся осадок отбрасывают, а супернатант разводят в 10 объемах калийфосфатного буфера, содержащего 0,15М натрия хлористого, рН 7,2-7,4. Полученную антигенсодержвщую суспензию наносят на колонку с иммуносорбентом (BrCn агароза с иммобилизованными в качестве лиганда моноклональными антителами к различным гликопротеинам вируса инфекционного ринотрахеита). После часовой инкубации в режиме реактора колонку промывают 10 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15М натрия хлористого, 0,1% Тритона Х-100, рН 7,2-7,4, и 5 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15М натрия хлористого, рН 7,2-7,4. После промывки колонки антигены элюируют 0,1М глициновым буфером, рН 2,0. Полученный таким способом антиген вируса инфекционного ринотрахеита является комплексом гликопротеинов с молекулярной массой от 54 до 180 килодальтон. Оптимальную концентрацию антигена для сенсибилизации микропанелей исследовали шахматным титрованием его с антиИРТ сывороткой в ИФА (таблица 1).

Пример 1. Антиген в концентрации 0,75 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2 - 7,4 разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Затем в лунки микропланшет добавляют по 0,1 см³ положительной контрольной сыворотки в разведениях от 1: 200 до 1:3200 в инкубационном буфере, приготовленном согласно п. 1.1. После часовой инкубации при +37^oС и пятикратной промывки инкубационным буфером в каждую лунку добавляют по 0,1 см³ рабочего разведения антивидового иммунопероксидазного коньюгата и инкубируют в течение часа при +37^oС. Затем микропланшеты пятикратно отмывают инкубационным буфером и проявляют реакцию субстратным буфером, приготовленным как описано в п.1.2. Реакцию учитывают через 30 минут спектрофотометрически при длине волны 492 нм. (ОП₄₉₂). Результаты выражают в оптических единицах (о.е.).

Пример 2. Антиген в концентрации 1,0 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4 разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в Примере 1.

Пример 3. Антиген в концентрации 1,25 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4 разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в Примере 1.

Пример 4. Антиген в концентрации 0,50 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4 разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в Примере 1.

Пример 5. Антиген в концентрации 1,50 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4 разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в Примере 1.

По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация аффинно очищенного антигена вируса инфекционного ринотрахеита - 1мкг/см³ адсорбционного буфера при разведении антиИРТ сыворотки 1:200 в инкубационном буфере и показана более высокая чувствительность заявляемого набора по сравнению с прототипом (Таблица 1).

3. Приготовление контрольных сывороток.

В качестве положительного контроля используют антиИРТ сыворотки, полученные от естественно переболевших инфекционным ринотрахеитом животных с титром в ИФА не ниже чем 1:12600. Для этого у животных проводят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см³ от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при +37^oС, затем делают обводку и для отстаивания сыворотку выдерживают 12-14 час при 4^oС. Затем сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об. /мин, инактивируют на водяной бане при 56^oС 40 мин. Затем сыворотку консервируют 0,02% азида натрия и разливают по 0,005 см³ в ампулы.

4. Приготовление нормальной (отрицательной) сыворотки.

У животных (крупного рогатого скота и др.), прошедших карантин в течение двух месяцев и отрицательно реагирующих в ИФА с антигеном вируса инфекционного ринотрахеита, проводят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см³ от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при +37^oС, затем делают обводку и для отстаивания сыворотку выдерживают 12-14 час при 4^oС. Отстоявшуюся сыворотку сливают во флаконы в асептических условиях и обрабатывают согласно п.3.

5. Получение антивидового коньюгата. Антивидовые иммуноглобулины антиIgG КРС, меченные ферментом пероксидазой, готовят в соответствии с "Временной инструкцией по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой", утвержденной ГУВ МСХ СССР 9.12.85 ТУ 46-21-78-85 (3) и укомплектовывают ими набор.

6. Иллюстрация применения набора.

6.1. Подготовка биологических компонентов набора для ретроспективной иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных.

Содержимое каждой ампулы или флакона 4 с антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом растворяют в 20 см³ инкубационного буфера, получая рабочую концентрацию коньюгата. Положительную и отрицательную (ампулы или фл.) 2 и 3 сыворотки растворяют в 1 см³ инкубационного буфера, получая разведение 1: 200. Растворенные сыворотки и антивидовой коньюгат можно хранить при температуре 5±1^oС в течение 3-4 дней.

6.2. Постановка иммуноферментной реакции (ИФА).

6.2.1. Титрование сывороток: сыворотки титруют по длинному ряду панели. Во все лунки панели, исключая лунку ряда панели 1А, используемую для контроля субстратной смеси и вывода прибора на "ноль", вносят по 0,1 см³ инкубационного буфера. В лунку ряда А (начиная с 2А) вносят по 0,1 см³ положительной сыворотки, подготовленной согласно п. 6.1., ряда В (начиная с 1В) - отрицательной сыворотки, подготовленной аналогичным способом согласно п.6.1. В 1-е лунки остальных рядов вносят по 0,1 см³ исследуемых проб сывороток, предварительно разведенных 1:200 в инкубационном буфере в отдельных пробирках или планшетах. Содержимое всех лунок титруют по длинному ряду для каждой сыворотки, используя при этом сменные наконечники к микропипеткам и получают разведение сывороток с 1:200 до 1:409600. Из последних лунок каждого ряда по 0,1 см³ содержимого удаляют. Микропанели закрывают крышкой, инкубируют при 37±0,5^oС в течение часа и затем пятикратно промывают инкубационным буфером.

В лунки отмытых микропанелей вносят по 0,1 см³ рабочего раствора антивидового коньюгата, подготовленного согласно п.6.1, инкубируют в термостате при 37±0,5^oС 1 час и промывают пять раз инкубационным буфером.

Для проявления реакции во все лунки панели вносят по 0,1 см³ раствора субстрата и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30 мин. Через 30 мин реакцию останавливают, добавляя в каждую лунку 0,05 см³ стоп-реагента 10.

Результат учитывают спектрофотометрически не позднее 30 мин после проявления реакции и выражают в единицах оптической плотности (ОП₄₉₂). За титр в ИФА принимают разведение сыворотки, дающее значение ОП₄₉₂, в 2 раза превышающее значение ОП₄₉₂ контрольной сыворотки.

6.2.2. При эпизоотологическом обследовании поголовья с целью выявления серопозитивных и серонегативных животных сыворотки не титруют, а используют в одном разведении 1:200, но в двух повторностях, используя для каждой сыворотки по 2 лунки плашки. Постановку реакции и подготовку сывороток осуществляют, как описано в п.6.2.1. Панели закрывают крышкой и выдерживают при температуре 37±0,5^oС в термостате в течение часа.

Отмывку микропанелей, внесение коньюгата и проявление реакции проводят как описано в п.6.2.1.

Результат учитывают не позднее 30 мин после проявления реакции визуально или спектрофотометрически.

Визуальный учет: при наличии специфических антител лунки с исследуемыми сыворотками имеют оранжево-коричневое окрашивание в разведении сыворотки 1: 200, сравнимое с цветом раствора в положительном контроле. Отрицательными считают пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плоскости (ОП₄₉₂). Положительными считают пробы, ОП_492. которых в разведении 1:200 в 2 и более раза превосходят оптическую плотность отрицательного контроля. Сомнительными считают пробы, ОП₄₉₂ которых составляет 0,150-0,199 о.е. Уровень оптической плотности ниже 0,150 о.е. свидетельствует об отрицательной реакции.

Предлагаемый набор был испытан при сравнительном титровании исследуемых сывороток методом ИФА и РН. (Таблица 2.).

Установлено, что в 86% случаях положительные результаты были получены в обоих методах. Все отрицательные сыворотки в ИФА были отрицательными и в РН. Однако в 14% случаях инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота диагностировался только при помощи заявляемого набора ИФА.

Источники информации
1. Технические условия 19.10.97-89 "Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 01.08.89 (прототип).

2. Паспорт Всероссийского контрольнгого института ветеринарных препаратов на штамм ТК-А (ВИЭВ) В2.

3. Технические условия 46-21-78-85 "Временная инструкция по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой", утвержденная ГУВ МСХ СССР 09.12.85,

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Набор содержит 96 луночных микропланшет, сенсибилизированных афинно очищенным антигеном вируса ИРТ, антиИРТ (положительную) и нормальную (отрицательную) нативные контрольные сыворотки, конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфоcфатного буфера, неионный детергент, 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент. Набор повышает чувствительность иммунологической реакции и сокращает время для проведения диагностики. 2 табл.

Набор для ретроспективной иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных, отличающийся тем, что он содержит 96 луночных микропланшет из полистирола, сенсибилизированных аффино очищенным антигеном вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ)В2, в количестве 0,075 - 0,125 мкг на лунку, антиИРТ (положительную) и нормальную (отрицательную) нативные контрольные сыворотки, конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент (Твин-20, -80 или Тритон Х-305), 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода, и стоп-реагент.