СРЕДСТВО, ПОДАВЛЯЮЩЕЕ РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 1997 года по МПК A61K33/00 

Изобретение относится к медицинt, фармакологии и касается средств, подавляющих рост опухолевых клеток.

В настоящее время исследовано множество веществ, подавляющих рост опухолевых клеток, однако один из них проявляет высокую токсичность в отношении здоровых клеток, что является лимитирующим фактором при их исследовании, другие обладают узким фармакологическим спектром действия.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является стабильный тяжелый изотоп водорода дейтерий (D), проявляющий противоопухолевую активность in vitro и in vivo.

Однако замена уже 30% H₂O на D₂O приводит к гибели животных, что свидетельствует о довольно высокой токсичности тяжелой дейтериевой воды.

Цель изобретения поиск новых средств, подавляющих пролиферацию опухолевых клеток и не обладающих высокой токсичностью для здоровых клеток.

В качестве средства, подавляющего рост опухолевых клеток предложен стабильный тяжелый изотоп кислорода ¹⁸O в концентрации его в среде не ниже 15% Стабильный изотоп кислорода ¹⁸O распространен в природе повсеместно в концентрации 0,2% и в этой концентрации не обладает цитотоксическими свойствами. Предлагаемое средство представляет собой стабильный изотоп кислорода формулы ¹⁸O при его содержании в среде не ниже 15% т.е. в 75 500 раз превышающем фоновый уровень этого изотопа в атмосферном кислороде и природной воде.

Эксперименты проведены в системе in vitro на двух видах опухолевых клеток человека: карциноме яичника (линия CaoV) и меланоме (линия MS).

Выбранные для исследования культуры клеток злокачественных опухолей человека отличается как по своему генезу, скорости роста в культуре, так и по степени чувствительности к известным противоопухолевым препаратам разных классов.

Поскольку тестирование антипрофилеративной активности соединений in vitro основано на применении водных культуральных сред, предложенное средство ¹⁸O вводили в среду в виде тяжело-кислородной воды H₂ ¹⁸O.

Исследование цитотоксического эффекта ¹⁸O на клетки карциномы яичника человека (линия CaoV).

Культура клеток CaoV растет в виде монослоя при 37^oC в стандартной питательной среде RPMI₁₆₄₀, содержащей 10% эмбрионной сыворотки теленка. Перед опытом клетки снимают со стекла раствором Версена, суспендируют в среде инкубации и рассеивают во флаконы по 2 мл.

В фазе экспоненциального роста опытные образцы заливают питательной средой RPMI₁₆₄₀, приготовленной на H₂ ¹⁸O[94,4 атом.¹⁸O] с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка. Максимальная конечная концентрация ¹⁸O в пробе составила 80 атом. Далее опытные образцы инкубировали в течение 24 ч, 48 ч или 72 ч. Рост клеток в опытных образцах сравнивали с ростом клеток в контрольных образцах, выращенных на стандартной питательной среде.

Цитотоксический эффект ¹⁸O определяли радиометрическим методом по включению ³H-тимидина (³H-T) в клетки CaoV•³H-T добавляли к пробам за 1 ч до окончания времени инкубации клеток. Результаты выражали в виде торможения включения ³H-T в клетки в опытных образцах по сравнению с уровнем включения ³H-T в контрольных образцах (%).

Исследовали зависимость цитотоксического эффекта ¹⁸O на рост клеток CaoV от времени инкубации при концентрации ¹⁸O в культуральной среде 80 атом. и зависимости эффекта от концентрации ¹⁸O в среде культивирования клеток [8,15,40,80 атом. ₁₈O] Результаты представлены в табл. 1 и 2.

Представленные в табл. 1 и 2 данные показаны, что
¹⁸O[80% обладает прямым цитотоксическим эффектом, величина которого прямо зависит от времени контакта клеток CaoV с H₂ ¹⁸O: через 48 ч инкубации 33% торможения включеия ³H-T в клетки, через 72 ч 73% торможения;
величина цитотоксического эффекта ¹⁸O относительно клеток CaoV зависит от концентрации ¹⁸O в среде культивирования: после 72 ч инкубации максимальное (65%) торможение включения ³H-T в клетки наблюдали при 80% концентрации ¹⁸O в среде; минимальное статистическое значение (17,5%) торможение при 15% концентрации ¹⁸O в среде.

Исследование цитотоксического эффекта ¹⁸O на клетки меланомы человека (линия MS).

Клетки меланомы человека MS росли в культуре в виде монослоя в среде DMEM-RPMI 1640 (1: 1) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка в газовой среде 5% CP₂ 95% воздуха при 37^oC. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в объеме 100 мкл по 300 клеток в лунке.

В контрольных образцах клетки выращивались в стандартной питательной среде на бидистилляте.

В опытных образцах в фазе экспоненциального роста клеток стандартную питательную среду на бидистилляте заменяли на питательную среду, приготовленную на H₂O¹⁸.

Цитотоксический эффект ¹⁸O оценивали с помощью MTT-теста, основанного на восстановлении тетразолия (MTT) митохондриальными дегидрогеназами живых клеток в голубой формазан, концентрацию которого определяли спектрофотометрически. Для этого после 72 ч культивирования клеток в каждую лунку (включая контрольное) добавляли 20 мкл MTT в концентрации 5 мг/мл. После 4 ч инкубации клеток с MTT при 37^oC среду роста удаляли полностью и образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в DMSO (60 мкл на лунку). Оптическую плотность раствора в каждой лунке с помощью сканирующего спектрометра Titertek Multiscan MCC\340 при длине волны 540 нм.

Каждой экспериментальной точке соответствовало 3 параллельных измерения. Парциальное поглощение (M+m) красителя в контрольных пробах, выращенных на среде DMEM-RPMI₁₆₄₀, растворенной в бидистиллированной H₂O, принято за 100%
Исследовали зависимость цитотоксического эффекта ¹⁸O на рост клеток меланомы MS от времени инкубации при концентрации ¹⁸O в культуральной среде 80 атом. и зависимости эффекта от концентрации ¹⁸O в среде культивирования (0,50,75,80 атом.).

Цитотоксический эффект ¹⁸O в опытных пробах определяли как фракцию выживших клеток по соотношению порциального поглощения опытных и контрольных образцов (%).

Результаты представлены в табл. 3 и 4.

Представленные в табл. 3 и 4 данные показывают, что
¹⁸O обладает прямым цитотоксическим эффектом на рост клеток MS;
максимальный цитотоксический эффект ¹⁸O на клетки MS наблюдается при концентрации ¹⁸O в культуральной среде 80 атом. при этом уже через 24 ч происходит гибель более 50% клеток;
величина цитотоксического эффекта ¹⁸O практически не зависит от времени инкубации: через 24 ч 42% выживших клеток, в течение последующих 48 ч эффект не изменяется;
величина цитотоксического эффекта ¹⁸O на рост клеток MS резко падает при понижении концентрации ¹⁸O в культуральной среде (при 75 атом. гибель 20% клеток, при 50 атом. гибель менее 20% клеток).

Использование двух различных методов тестирования антипролиферативной активности ¹⁸O, один из которых (MTT-тест) регистрируют только фракцию живых клеток, а другой (радиометрический тест) оценивает суммарный эффект (цитостатический и цитотоксический), позволяет сделать вполне обоснованный вывод, что ¹⁸O оказывает не просто цитотоксическое действие, а вызывает необратимое повреждение (гибель) клеток.

Максимальным цитотоксическим эффектом ¹⁸O обладает при концентрации в культуральной среде 80 атом. вызывая гибель 50 70% злокачественных опухолевых клеток.

Минимальный статистически значимый цитотоксический эффект (17,5% торможения роста клеток) оказывает ¹⁸O в концентрации 15% в культуральной среде.

Таким образом, экспериментальными исследованиями in vitro на примере двух видов злокачественных опухолевых клеток (CaoV и MS), различных по происхождению, кинетике роста в культуре и лекарственной чувствительности, впервые показано, что тяжелый стабильный изотоп кислорода ¹⁸O, оказывает подавляющее действие на рост опухолевых клеток.

Изобретение относится к медицине, фармакологии и касается средств, подавляющих рост опухолевых клеток. Сущность изобретения заключается в том, что заявляемое средство представляет собой стабильный тяжелый изотоп кислорода формулы ¹⁸O при его содержании в среде не ниже 15%. 4 табл.

Средство, подавляющее рост опухолевых клеток, отличающееся тем, что оно представляет собой стабильный тяжелый изотоп кислорода формулы ^1 8О при его содержании в среде не ниже 15%