СРЕДСТВО, ПОДАВЛЯЮЩЕЕ РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 1997 года по МПК A61K33/00 

Описание патента на изобретение RU2095066C1

Изобретение относится к медицинt, фармакологии и касается средств, подавляющих рост опухолевых клеток.

В настоящее время исследовано множество веществ, подавляющих рост опухолевых клеток, однако один из них проявляет высокую токсичность в отношении здоровых клеток, что является лимитирующим фактором при их исследовании, другие обладают узким фармакологическим спектром действия.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является стабильный тяжелый изотоп водорода дейтерий (D), проявляющий противоопухолевую активность in vitro и in vivo.

Однако замена уже 30% H2O на D2O приводит к гибели животных, что свидетельствует о довольно высокой токсичности тяжелой дейтериевой воды.

Цель изобретения поиск новых средств, подавляющих пролиферацию опухолевых клеток и не обладающих высокой токсичностью для здоровых клеток.

В качестве средства, подавляющего рост опухолевых клеток предложен стабильный тяжелый изотоп кислорода 18O в концентрации его в среде не ниже 15% Стабильный изотоп кислорода 18O распространен в природе повсеместно в концентрации 0,2% и в этой концентрации не обладает цитотоксическими свойствами. Предлагаемое средство представляет собой стабильный изотоп кислорода формулы 18O при его содержании в среде не ниже 15% т.е. в 75 500 раз превышающем фоновый уровень этого изотопа в атмосферном кислороде и природной воде.

Эксперименты проведены в системе in vitro на двух видах опухолевых клеток человека: карциноме яичника (линия CaoV) и меланоме (линия MS).

Выбранные для исследования культуры клеток злокачественных опухолей человека отличается как по своему генезу, скорости роста в культуре, так и по степени чувствительности к известным противоопухолевым препаратам разных классов.

Поскольку тестирование антипрофилеративной активности соединений in vitro основано на применении водных культуральных сред, предложенное средство 18O вводили в среду в виде тяжело-кислородной воды H218O.

Исследование цитотоксического эффекта 18O на клетки карциномы яичника человека (линия CaoV).

Культура клеток CaoV растет в виде монослоя при 37oC в стандартной питательной среде RPMI1640, содержащей 10% эмбрионной сыворотки теленка. Перед опытом клетки снимают со стекла раствором Версена, суспендируют в среде инкубации и рассеивают во флаконы по 2 мл.

В фазе экспоненциального роста опытные образцы заливают питательной средой RPMI1640, приготовленной на H218O[94,4 атом.18O] с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка. Максимальная конечная концентрация 18O в пробе составила 80 атом. Далее опытные образцы инкубировали в течение 24 ч, 48 ч или 72 ч. Рост клеток в опытных образцах сравнивали с ростом клеток в контрольных образцах, выращенных на стандартной питательной среде.

Цитотоксический эффект 18O определяли радиометрическим методом по включению 3H-тимидина (3H-T) в клетки CaoV•3H-T добавляли к пробам за 1 ч до окончания времени инкубации клеток. Результаты выражали в виде торможения включения 3H-T в клетки в опытных образцах по сравнению с уровнем включения 3H-T в контрольных образцах (%).

Исследовали зависимость цитотоксического эффекта 18O на рост клеток CaoV от времени инкубации при концентрации 18O в культуральной среде 80 атом. и зависимости эффекта от концентрации 18O в среде культивирования клеток [8,15,40,80 атом. 18O] Результаты представлены в табл. 1 и 2.

Представленные в табл. 1 и 2 данные показаны, что
18O[80% обладает прямым цитотоксическим эффектом, величина которого прямо зависит от времени контакта клеток CaoV с H218O: через 48 ч инкубации 33% торможения включеия 3H-T в клетки, через 72 ч 73% торможения;
величина цитотоксического эффекта 18O относительно клеток CaoV зависит от концентрации 18O в среде культивирования: после 72 ч инкубации максимальное (65%) торможение включения 3H-T в клетки наблюдали при 80% концентрации 18O в среде; минимальное статистическое значение (17,5%) торможение при 15% концентрации 18O в среде.

Исследование цитотоксического эффекта 18O на клетки меланомы человека (линия MS).

Клетки меланомы человека MS росли в культуре в виде монослоя в среде DMEM-RPMI 1640 (1: 1) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка в газовой среде 5% CP2 95% воздуха при 37oC. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в объеме 100 мкл по 300 клеток в лунке.

В контрольных образцах клетки выращивались в стандартной питательной среде на бидистилляте.

В опытных образцах в фазе экспоненциального роста клеток стандартную питательную среду на бидистилляте заменяли на питательную среду, приготовленную на H2O18.

Цитотоксический эффект 18O оценивали с помощью MTT-теста, основанного на восстановлении тетразолия (MTT) митохондриальными дегидрогеназами живых клеток в голубой формазан, концентрацию которого определяли спектрофотометрически. Для этого после 72 ч культивирования клеток в каждую лунку (включая контрольное) добавляли 20 мкл MTT в концентрации 5 мг/мл. После 4 ч инкубации клеток с MTT при 37oC среду роста удаляли полностью и образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в DMSO (60 мкл на лунку). Оптическую плотность раствора в каждой лунке с помощью сканирующего спектрометра Titertek Multiscan MCC\340 при длине волны 540 нм.

Каждой экспериментальной точке соответствовало 3 параллельных измерения. Парциальное поглощение (M+m) красителя в контрольных пробах, выращенных на среде DMEM-RPMI1640, растворенной в бидистиллированной H2O, принято за 100%
Исследовали зависимость цитотоксического эффекта 18O на рост клеток меланомы MS от времени инкубации при концентрации 18O в культуральной среде 80 атом. и зависимости эффекта от концентрации 18O в среде культивирования (0,50,75,80 атом.).

Цитотоксический эффект 18O в опытных пробах определяли как фракцию выживших клеток по соотношению порциального поглощения опытных и контрольных образцов (%).

Результаты представлены в табл. 3 и 4.

Представленные в табл. 3 и 4 данные показывают, что
18O обладает прямым цитотоксическим эффектом на рост клеток MS;
максимальный цитотоксический эффект 18O на клетки MS наблюдается при концентрации 18O в культуральной среде 80 атом. при этом уже через 24 ч происходит гибель более 50% клеток;
величина цитотоксического эффекта 18O практически не зависит от времени инкубации: через 24 ч 42% выживших клеток, в течение последующих 48 ч эффект не изменяется;
величина цитотоксического эффекта 18O на рост клеток MS резко падает при понижении концентрации 18O в культуральной среде (при 75 атом. гибель 20% клеток, при 50 атом. гибель менее 20% клеток).

Использование двух различных методов тестирования антипролиферативной активности 18O, один из которых (MTT-тест) регистрируют только фракцию живых клеток, а другой (радиометрический тест) оценивает суммарный эффект (цитостатический и цитотоксический), позволяет сделать вполне обоснованный вывод, что 18O оказывает не просто цитотоксическое действие, а вызывает необратимое повреждение (гибель) клеток.

Максимальным цитотоксическим эффектом 18O обладает при концентрации в культуральной среде 80 атом. вызывая гибель 50 70% злокачественных опухолевых клеток.

Минимальный статистически значимый цитотоксический эффект (17,5% торможения роста клеток) оказывает 18O в концентрации 15% в культуральной среде.

Таким образом, экспериментальными исследованиями in vitro на примере двух видов злокачественных опухолевых клеток (CaoV и MS), различных по происхождению, кинетике роста в культуре и лекарственной чувствительности, впервые показано, что тяжелый стабильный изотоп кислорода 18O, оказывает подавляющее действие на рост опухолевых клеток.

Похожие патенты RU2095066C1

название год авторы номер документа
СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА 1995
  • Вольпин М.Е.
  • Ворожцов Г.Н.
  • Герасимова Г.К.
  • Жукова О.С.
  • Казачкина Н.И.
  • Калия О.Л.
  • Крайнова Н.Ю.
  • Левитин И.Я.
  • Лужков Ю.М.
  • Лукьянец Е.А.
  • Новодарова Г.Н.
  • Трещалина Е.М.
  • Сыркин А.Б.
  • Чиссов В.И.
  • Якубовская Р.И.
RU2106146C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2007
  • Нифантьев Эдуард Евгеньевич
  • Коротеев Михаил Петрович
  • Казиев Гарри Захарович
  • Кухарева Татьяна Семеновна
  • Жукова Ольга Степановна
  • Смирнова Зоя Сергеевна
RU2349317C1
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 2010
  • Манина Ирина Владимировна
  • Михайлова Ирина Николаевна
  • Козлов Алексей Михайлович
  • Барышников Анатолий Юрьевич
RU2458120C1
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ А4 Т-ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ СКРИНИНГА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ 2004
  • Соколовская Алиса Анатольевна
  • Заботина Татьяна Николаевна
  • Михайлов Андрей Дмитриевич
  • Блохин Дмитрий Юрьевич
  • Барышников Анатолий Юрьевич
RU2267532C1
ПРОИЗВОДНЫЕ ИНДОЛОКАРБАЗОЛОВ, БЛОКИРУЮЩИЕ ВАСКУЛОГЕННУЮ МИМИКРИЮ В ОПУХОЛИ 2014
  • Вартанян Амалия Арташевна
  • Барышникова Мария Анатольевна
  • Еремина Вера Александровна
  • Миникер Татьяна Давидовна
  • Тихонова Надежда Ивановна
  • Кузьмина Наталья Евгеньевна
  • Эктова Лидия Владимировна
RU2557554C1
СПОСОБ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В СЛОЖНЫХ СМЕСЯХ И ЭКСТРАКТАХ НИТРОПРОИЗВОДНЫХ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ, ИМЕЮЩИХ ФОСФОРЕСЦЕНЦИЮ В ЗАМОРОЖЕННЫХ РАСТВОРАХ 1997
  • Левинский С.С.
  • Хесина А.Я.
  • Кривошеева Л.В.
  • Хитрово И.А.
RU2122199C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ 2009
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Анисимова Наталья Юрьевна
  • Соснов Андрей Владимирович
RU2402338C1
Способ определения способности клеток секретировать простагландин Е в среду культивирования 1987
  • Ключарева Татьяна Евгеньевна
  • Матвеева Валентина Александровна
SU1529125A1
ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ТРИИНДОЛИЛМЕТАНА В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СРЕДСТВ 2010
  • Лавренов Сергей Николаевич
  • Исакова Елена Борисовна
  • Преображенская Мария Николаевна
  • Трещалин Иван Дмитриевич
  • Личиницер Михаил Романович
  • Степанова Евгения Владиславовна
  • Соломко Элисо Шаликовна
  • Абрамов Михаил Евгеньевич
  • Штиль Александр Альбертович
  • Бухман Владимир Михайлович
RU2454232C2
Полипептиды для лечения онкологических заболеваний 2017
  • Боженко Владимир Константинович
  • Кулинич Татьяна Михайловна
  • Кудинова Елена Александровна
  • Шишкин Александр Михайлович
  • Солодкий Владимир Алексеевич
RU2728870C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 095 066 C1

Реферат патента 1997 года СРЕДСТВО, ПОДАВЛЯЮЩЕЕ РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Изобретение относится к медицине, фармакологии и касается средств, подавляющих рост опухолевых клеток. Сущность изобретения заключается в том, что заявляемое средство представляет собой стабильный тяжелый изотоп кислорода формулы 18O при его содержании в среде не ниже 15%. 4 табл.

Формула изобретения RU 2 095 066 C1

Средство, подавляющее рост опухолевых клеток, отличающееся тем, что оно представляет собой стабильный тяжелый изотоп кислорода формулы 18О при его содержании в среде не ниже 15%

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1997 года RU2095066C1

Лобышев В.И., Калиниченко Л.П
Изотопные эффекты DO в биологических системах
- М.: Наука, 1978, с
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1

RU 2 095 066 C1

Авторы

Медведовская Н.И.

Сыркин А.Б.

Герасимова Г.К.

Власенкова Н.К.

Жукова О.С.

Иванова Т.П.

Даты

1997-11-10Публикация

1996-12-25Подача