СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ И ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АМИНОКИСЛОТ Российский патент 1997 года по МПК G01N30/94 

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно, к тонкослойной двумерной хроматографии смесей аминокислот.

Изобретение может найти применение при анализе чистоты аминокислот, производимых в промышленности, в медицине, в частности для дифференциальной диагностики наследственных дефектов обмена веществ, при аминокислотном анализе в пищевой и перерабатывающей промышленности и т.п.

Для разделения аминокислот используются различные хроматографические и электрофоретические методы. Наиболее широко применяются тонкослойная (ТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография. Достоинствами метода ТСХ являются простота, отсутствие дорогостоящего оборудования, а значит, доступность массовому потребителю, и высокая скорость анализа.

Принципиальным моментом для проведения ТСХ аминокислот является выбор сорбирующего слоя, наносимого на подложку, и хроматографической системы растворителей. Для ТСХ всего спектра известных аминокислот до сих пор не подобраны универсальные условия разделения (сорбент система растворителей). Это связано с тем, что сам объект смесь аминокислот условно распадается на две группы с низкими (до 0,3) и высокими (0,3-1,0) значениями коэффициента подвижности R_f^*(Коэффициент подвижности отношение скорости миграции данной аминокислоты к скорости миграции фронта растворителя) /1/. Тем не менее известны попытки разделения не всего спектра, а 20 основных аминокислот биологических жидкостей.

Так, известен способ разделения основных аминокислот в биологических жидкостях с помощью одномерной ТСХ^**(Одномерная ТСХ ТСХ, предполагающая элюирование пластинки в одном направлении) на пластинках "Силуфол" (ЧССР) и фирмы "Merck" (Германия) со слоем сорбента силикагеля /1/. Для разделения используют системы растворителей: н-бутанол ледяная уксусная кислота вода в соотношении 3: 1:1 (по объему). Разделение аминокислот протекает за 2 ч при комнатной температуре. Окрашивание хроматограмм (детектирование) производят погружением пластинки в нингидриновый реактив. Окраска проявляется в темноте в течение 2 ч. Способ позволяет разделить 11 аминокислот с R_f≅0,13 и R_f≥0,4. Аминокислоты с промежуточными значениями R_f не поддаются интерпретации известным способом из-за перегруженности этой области аминокислотам и неэффективности данной системы растворителей для их разделения. Известный способ рекомендован в качестве экспресс-метода анализа аминокислот биологических жидкостей, однако только для предварительной диагностики заболевания. Результаты анализа приходится подтверждать с помощью дополнительных методик определения конкретных аминокислот.

Известен способ разделения 15 основных аминокислот с помощью двумерной ТСХ*** (Двумерная ТСХ ТСХ, предполагающая элюирование пластинки в двух взаимно перпендикулярных направлениях) на силикагеле фирмы Whatman (США) с последовательным использованием двух систем растворителей: н-бутанол - уксусная кислота вода (4: 1:5) и фенол вода (15:1) /2/. Детектирование аминокислот проводят с использованием нингидринового реактива. Этот способ разделения аминокислот наиболее эффективен из известных аналогов, но длителен по времени ( > 7 ч). Способ позволяет разделить с хорошим результатом 15 аминокислот из 20 основных аминокислот биологических жидкостей.

Таким образом, проблема разделения аминокислот до сих пор не решена.

Задачей изобретения является разработка метода разделения и анализа широкого спектра аминокислот ( > 20).

Поставленная задача решается способом разделения и детектирования аминокислот с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле с последовательным использованием двух систем растворителей: изопропиловый спирт ацетон 24-25% -ный водный раствор аммиака вода в соотношении (19,0-27,0): (20,0-26,0): (3,0-6,5): (6,0-10,0) (по объему) и хлороформ этанол уксусная кислота вода в соотношении (23,0-27,0):(13,5-16,0):(4,0-6,5):(1,3-3,5) (по объему). Окрашивание разделенных аминокислот проводят нингидриновым реактивом, дополнительно используют реактивы Эрлиха и Несслера.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Для анализа аминокислот могут быть использованы пластинки со слоем силикагеля фирмы "Merck", "Силуфол" и "Сорбфил" /1/ размером 10х10 или 10х15 см.

Для разделения аминокислот приготавливают раствор смеси 22 стандартной аминокислоты в 25%-ном этаноле в концентрации 1 мг/мл.

0,5 мкл раствора смеси стандартных аминокислот наносят в точку на расстоянии 1,5 см от нижнего и левого краев пластины. Раствор наносят при помощи микрошприца V=1 мкл.

Хроматографию осуществляют восходящим способом последовательно в двух хроматографических камерах размером 29,0х22,5х16,0 см.

Камеры для ТСХ предварительно заряжают системой растворителей и насыщают в течение 12-16 ч под плотно притертой крышкой.

Пластину с нанесенным образцом погружают нижним краем в хроматографическую камеру с системой растворителей изопропиловый спирт - ацетон 25%-ный раствор аммиака вода (26,0-22,0:4,2:8,5) (по объему) и хроматографируют на расстояние примерно 60 мм от линии старта.

После высушивания на воздухе пластину поворачивают на 90^o (так, чтобы точка нанесения образца находилась в нижнем правом углу пластинки) и опускают в хроматографическую камеру с системой растворителей хлороформ этанол - уксусная кислота вода (24,5:13,5:4,0:2,2) (по объему), и хроматографируют на расстояние примерно 60 мм от линии старта. Пластинку высушивают на воздухе.

Время ТСХ 2-2,5 ч.

Детектирование хроматограмм производят нингидриновым реактивом при помощи пульверизатора или методом окунания. Состав нингидринового реактива: 100 мг нингидрина, 100 мл ацетона, 1 мл ледяной уксусной кислоты. Проявление окраски происходит в термостате при 45^oC (5 мин). Для детектирования триптофана используют реактив Эрлиха. Для детектирования серина и треонина используют реактив Несслера 3.

Для идентификации конкретных аминокислот на хроматограмме смеси аминокислот предварительно проводят хроматографирование каждой из стандартных аминокислот в условиях вышеприведенного примера. Полученные хроматограммы являются эталоном для любых последующих анализов смесей аминокислот. Воспроизводимость результатов проверена на пластинках "Сорбфил", "Merck", "Силуфол" и для различных биологических жидкостей.

Аналогичным образом проводят разделение аминокислот биологических жидкостей (мочи, крови). Биологические жидкости готовят согласно методике, описанной в /1/.

Реализация заявленного интервала соотношений ингредиентов систем растворителей (включая граничные) приводит к эффективному разделению смеси стандартных аминокислот и аминокислот биологических жидкостей. На хроматограммах сохраняется порядок расположения аминокислот.

Даже незначительный выход за рамки заявляемого соотношения инградиентов двух систем растворителей и концентрации раствора аммиака приводит к резкому снижению эффективности разделения. Преимущество заявляемого способа - способность разделить 22 аминокислоты (В способе-прототипе 15 аминокислот). Таким образом, подтверждается эффективность разделения аминокислот с помощью заявляемого способа выше. Разделение аминокислот в случае заявляемого изобретения протекает значительно быстрее (за 2-2,5 ч), чем в способе-прототипе ( > 7 ч). Кроме того, предлагаемые две системы растворителей могут быть использованы (одновременно) при ТСХ на пластинках со слоем силикагеля разных фирм ("Merck", "Силуфол", "Сорбфил), т.е. универсальны для разделения аминокислот на силикагеле.

Назначение: изобретение относится к аналитической химии, а именно, к тонкослойной хроматографии аминокислот, и может найти применение при анализе чистоты аминокислот, производимых в промышленности, и в медицине - для диагностики наследственных дефектов обмена веществ. Сущность изобретения: аминокислоты разделяют двумерной тонкослойной хроматографией с последовательным использованием двух хроматографических систем растворителей: изопропанол - ацетон - 24-25%-ный раствор аммиака - вода в соотношении (19,0-27,0): (20,0-26,0): (3,0-6,5):(6,0-10,0) (по объему) и хлороформ - этанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении (23,0-27,0):(13,5-16,0):(4,5-6,5): (1,3-3,5) (по объему). Для детектирования аминокислот используют нингидриновый реактив и дополнительно реактивы Эрлиха, Несслера.

Способ разделения и детектирования аминокислот с использованием двумерной тонкослойной хроматографии, включающий нанесение пробы на основу с силикагелем, последовательную обработку основы двумя системами растворителей и детектирование разделенных аминокислот нингидриновым реагентом, отличающийся тем, что используют системы растворителей состава: изопропанол ацетон 24 - 25% -ный раствор аммиака вода в соотношении по объему 19 27 20 26 3,0 6,5 6 10 и хлороформ этанол уксусная кислота вода в соотношении по объему 23 27 13,5 16,0 4,0 6,5 1,3 3,5, а для детектирования аминокислот дополнительно используют реактива Эрлиха и Несслера.