СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДА В МОЛОКЕ И МЯСЕ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/02 G01N30/90 

Изобретение относится к аналитической химии пестицидов, в частности к способам определения пестицидов в сельскохозяйственной продукции и объектах окружающей среды с помощью тонкослойной хроматографии, и может использоваться при контроле за содержанием в молоке и мясе N,N-дициклогексиламида сорбиновой кислоты (в дальнейшем изложении именуемого сорбамидом), входящего в состав препаратов "Дарулан" и "Дицаваз".

Известные способы определения микроколичеств N,N-дизамещенных амидов карбоновых кислот используют метод тонкослойной хроматографии на пластинках с тонким слоем силикагеля или оксида алюминия, закрепленным сернокислым кальцием либо гипсом и нанесенным вручную на стеклянные пластинки [1-3]
Так, известен способ определения в воздухе рабочей зоны пестицида дифенамид, содержащего N, N-дизамещенную амидную группу, с помощью метода тонкослойной хроматографии в тонком слое оксида алюминия, закрепленного сернокислым кальцием и нанесенного вручную на стеклянную пластинку, в подвижной фазе, состоящей из смеси гексана, ацетона и аммиака в объемном отношении 10: 5: 0,8 с последующей обработкой хроматограмм реактивом Драгендорфа. Предел обнаружения 1 мкг [2]
Недостатком способа является использование нестандартных хроматографических пластинок с тонким слоем сорбента, нанесенным вручную, что снижает точность, чувствительность, селективность определения из-за неравномерной толщины слоя сорбента.

Обычно применяемые в анализе стандартные хроматографические пластинки (Силуфол, Алуфол, пластинки Армянского филиала ИРЕА "Армсорб" и др.) содержат в качестве связующего вещества крахмал. Обработка таких пластинок реактивом Драгендорфа и различными его модификациями [4 и 5] приводит к тому, что фон пластинки темнеет вследствие воздействия на крахмал свободного иода, выделяющегося в результате окислительно-восстановительных реакций с участием иодистого калия или натрия, входящего в состав реактива. Это обстоятельство мешает идентификации пятна исследуемого вещества на хроматограмме, поскольку оранжевые пятна маскируются темным фоном пластинки. Поэтому определение вещества как качественное, так и количественное на таких пластинках с помощью реактива Драгендорфа затруднено.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения остаточных количеств пестицида в молоке [6] предусматривающий экстракцию пестицида из исследуемой пробы и из полученного жирового остатка, очистку и концентрацию экстрактов с последующим их элюированием подвижным растворителем, нанесение пробы на пластинку со слоем сорбента, хроматографирование, проявление зон локализации искомого компонента (остаточного количества пестицида) путем обработки хроматограмм реактивом с последующим количественным определением искомого компонента по результатам визуального сравнения интенсивности окраски и размера пятен пробы с аналогичными характеристиками пятен стандартных растворов.

Недостатком данного способа является невозможность определения микроколичества сорбамида, входящего в состав препарата "Дарулан" и "Дицаваз" при исследовании качества мясных и молочных продуктов на остаточное количество пестицидов.

Предлагаемый способ позволяет устранить недостаток за счет того, что закрепление тонкого слоя сорбента на хроматографических пластинках в подвижной фазе осуществляют крахмалом, в качестве подвижной фазы используют смесь четыреххлористого углерода с ацетоном в объемном соотношении (20-15):1, а для обнаружения зон локализации сорбамида на хроматографических пластинках из ряда реактивов выбирают реактив Драгендорфа, модифицированный 0,2%-ным водным раствором аскорбиновой кислоты.

Для хроматографического разделения анализируемой пробы используют в качестве сорбента хроматографические пластинки "Силуфол", пластинки "Армсорб" Армянского филиала ИРЕА и другие стандартные пластинки с тонким слоем силикагеля, закрепленного крахмалом, и в качестве хромогенного реагента модифицированный реактив Драгендорфа, содержащий, в отличие от вышеуказанных рецептур, аскорбиновую кислоту, сульфит или бисульфит натрия, которые благодаря восстановительным свойствам связывают свободный иод, вследствие чего фон пластинки становится светло-желтым. Применение аскорбиновой кислоты является предпочтительным, так как окраска фона пластинки остается стабильной более длительное время, чем при применении сульфита и бисульфита натрия.

С целью обеспечения возможности определения микроколичеств сорбамида в сельскохозяйственной продукции, в частности в молоке и мясе, анализируемую пробу предварительно экстрагируют соответствующим экстрагентом, экстракт подвергают очистке и концентрированию, а затем проводят количественное определение следующим образом.

На стандартной хроматографической пластинке с тонким слоем сорбента, закрепленного крахмалом, на расстоянии 15 мм от края намечают линию старта и на ее середину с помощью микрошприца наносят экстракт анализируемой пробы, а справа и слева от пятна пробы на расстоянии 15 мм одно от другого наносят стандартные пятна-свидетели с различным содержанием исследуемого вещества. Диаметр нанесенных пятен не должен превышать 10 мм, количество пятен на пластинке 7-9.

Способ осуществляется следующим образом.

Пластинку помещают в закрытую пришлифованной стеклянной пластинкой хроматографическую камеру размером 16х8х20 см, заполненную за 30 мин до хроматографирования (для насыщения камеры парами растворителей) подвижной фазой, состоящей из смеси четыреххлористого углерода с ацетоном (все компоненты квалификации "хч" или "чда"). Оптимальное объемное соотношение четыреххлористого углерода и ацетона (20-15):1. Увеличение или уменьшение этого соотношения приводит к размыванию пятен, нечеткому их контуру, а следовательно, к снижению точности и чувствительности анализа.

Количество подвижной фазы в хроматографической камере должно быть таким, чтобы хроматографическая пластинка погружалась в подвижную фазу не более чем на 0,5 см. Пластинку элюируют восходящим способом, высота поднятия фронта подвижной фазы 10 см. Продолжительность элюирования 15-20 мин. Затем пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе 5-8 мин и обрабатывают из пульверизатора реактивом Драгендорфа, модифицированным водным раствором аскорбиновой кислоты.

Модифицированный реактив Драгендорфа получают растворением 850 мг основного азотнокислого висмута в 40 мл воды и 10 мл уксусной кислоты. В этот раствор добавляют 8 г иодистого калия, растворенного в 20 мл воды. Для обработки хроматограммы 1 мл полученного раствора разбавляют 2 мл уксусной кислоты и 10 мл 0,2%-ного водного раствора аскорбиновой кислоты. Указанная концентрация водного раствора аскорбиновой кислоты является оптимальной. Уменьшение концентрации водного раствора аскорбиновой кислоты приводит к быстрому потемнению фона пластинки, а увеличение концентрации не повышает эффективность действия аскорбиновой кислоты.

После обработки хроматограммы реактивом Драгендорфа, модифицированным аскорбиновой кислотой, проявляются пятна сорбамида оранжевого цвета с соответствующим значением R_f.

Количественное определение проводят или путем сравнения интенсивности окраски и площади пятен исследуемого вещества и стандартного, или по калибровочной зависимости площади пятна (мм²) от количества (мкг) вещества, или с помощью денситометра по отношению интегральных значений содержания вещества в пятнах пробы и стандартного.

П р и м е р 1. В мерной колбе готовят раствор сорбамида в ацетоне концентрации 0,05 мг/мл.

На середину линии старта хроматографической пластинки "Силуфол" наносят в виде пятна 10 мкл этого раствора, что соответствует содержанию сорбамида в пятне 0,5 мкг. По обеим сторонам от пятна пробы наносят в виде отдельных пятен на расстоянии 15 мм друг от друга по 10 мкл стандартных растворов сорбамида с концентрациями 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,80; 1,0 мг/мл. Пластинку элюируют в подвижной фазе четыреххлористый углерод + ацетон (15:1) на высоту 10 см, а затем обрабатывают из пульверизатора реактивом Драгендорфа, модифицированным аскорбиновой кислотой. На хроматограмме проявляются четкие оранжевые пятна сорбамида на светло-желтом фоне с R_f 0,42. По калибровочному графику, построенному по зависимости площади стандартных пятен от содержания в них сорбамида, определено в пятне пробы 0,52 мкг. Относительная ошибка определения составляет 5%
П р и м е р 2. Определение проводят аналогично примеру 1, но для модификации реактива Драгендорфа используют 0,1%-ный водный раствор аскорбиновой кислоты. Светло-желтая окраска фона через 6-7 мин темнеет.

П р и м е р 3. Определение проводят аналогично примеру 1, но для модификации реактива Драгендорфа используют 0,4%-ный водный раствор аскорбиновой кислоты. Результат определения совпадает с результатом примера 1.

П р и м е р 4. Определение проводят аналогично примеру 1, но на хроматографическую пластинку наносят 10 мкл ацетонового раствора сорбамида концентрации 0,5 мк/мл, что соответствует содержанию сорбамида в пятне 5 мкг. Обнаружено 5,25 мкг. Значение R_f 0,43. Относительная ошибка определения 5%
П р и м е р 5. Определение проводят аналогично примеру 1, но на хроматографическую пластинку наносят 10 мкл ацетонового раствора сорбамида концентрации 1 мг/мл, что соответствует содержанию сорбамида в пятне 10 мкл. Обнаружено 9,5 мкг. Относительная ошибка определения 5% Значение R_f 0,44.

П р и м е р 6. Определение проводят аналогично примеру 1, но объемное соотношение компонентов подвижной фазы четыреххлористый углерод + ацетон составляет 20: 1. Значение R_f сорбамида 0,42. Предел обнаружения 0,5 мкг. Относительная ошибка определения 5%
П р и м е р 7. Определение проводят аналогично примеру 1, но объемное соотношение компонентов подвижной фазы четыреххлористый углерод + ацетон составляет 7:1. Значение R_f сорбамида 0,72. Предел обнаружения 1 мкг. Пятно сорбамида нечеткое, размытое. Относительная ошибка определения 9,8%
П р и м е р 8. Определение проводят аналогично примеру 1, но объемное соотношение компонентов подвижной фазы четыреххлористый углерод + ацетон составляет 30:1. Значение R_f сорбамида 0,35. Предел обнаружения 1 мкг. Пятно нечеткое. Относительная ошибка определения 10,2%
П р и м е р 9. Определение проводят аналогично примеру 1, но для обработки хроматограмм используют реактив Драгендорфа без модификации его водным раствором аскорбиновой кислоты. Пятно сорбамида на хроматограмме маскируется темно-синим фоном. Определение невозможно.

П р и м е р 10. Определение проводят аналогично примеру 1, но используют хроматографическую пластину "Армсорб". Значение R_f для сорбамида 0,87. Предел обнаружения 0,5 мкг. Относительная ошибка определения 5%
П р и м е р 11. 200 мл молока с содержанием сорбамида 0,005 мг/л вливают в 300 мл ацетона, выдерживают в течение 15 мин, затем фильтруют под вакуумом, остаток на фильтре промывают 20 мл ацетона. Фильтрат переносят в колбу с притертой пробкой, вносят 40 г хлористого натрия, закрывают пробкой и интенсивно встряхивают до появления эмульсии (1-3 мин). Эмульсию сливают в делительную воронку и экстрагируют сорбамид тремя порциями гексана по 100 мл. Гексановые экстракты объединяют, осушают, пропуская через слой безводного сульфата натрия (80 г), упаривают до отсутствия запаха растворителя. Маслянистый остаток растворяют в 1-2 мл гексана и переносят в колонку с оксидом алюминия, обмывая колбу 2-3 раза такими же порциями гексана. Гексан отсасывают под вакуумом, колонку элюируют со скоростью 80-100 капель в минуту сначала 30 мл гексана (элюат отбрасывают), а затем смесью (10 мл) гексан + ацетон в объемном соотношении 50:1. Этот элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл гексана, а затем испаряют в слабом токе воздуха до объема 0,2-0,3 мл. Этот объем с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят на хроматографическую пластинку "Силуфол" и проводят определение аналогично примеру 1. Значение R_f сорбамида 0,43. В анализируемой пробе обнаружено 0,004 мг/л сорбамида. Суммарная относительная погрешность определения 20%
П р и м е р 12. 40 г измельченного говяжьего мяса с содержанием сорбамида 0,05 мг/кг экстрагируют дважды смесью 60 мл ацетона с 10 мл воды, встряхивая каждый раз по 30 мин, и фильтруют под вакуумом. Остаток на фильтре промывают 20 мл ацетона. В объединенный фильтрат вносят 30 г хлористого натрия и интенсивно встряхивают до появления эмульсии. Эмульсию сливают в делительную воронку и экстрагируют гексаном тремя порциями по 60 мл. Объединенные экстракты осушают, пропуская через слой безводного сульфата натрия (40 г). Экстракт упаривают до отсутствия запаха растворителей и далее поступают как в примере 11. Значение R_f сорбамида 0,43. Количество вещества, определенное в пробе, соответствует содержанию сорбамида 0,04 мг/кг. Суммарная относительная ошибка определения 20%
П р и м е р 13. Определение проводят аналогично примеру 11, но анализируемая проба молока содержит 0,002 мг/кг сорбамида. Обнаружено пятно сорбамида, не поддающееся количественному определению.

Таким образом, данный способ позволяет:
проводить определение сорбамида в молоке и мясе;
расширить возможность анализа сорбамида методом тонкослойной хроматографии за счет применения наряду с нестандартными пластинками с тонким слоем сорбента, закрепленного сернокислым кальцием или гипсом, стандартных хроматографических пластинок с тонким слоем сорбента, закрепленного крахмалом;
повысить селективность анализа за счет применения в качестве подвижной фазы смеси четыреххлористого углерода и ацетона в объемном соотношении (20-15): 1, что позволяет получать четкое пятно сорбамида, а также отделять пятно сорбамида от мешающих коэкстрактивных веществ, извлекаемых при экстракции из молока и мяса;
увеличить точность за счет применения стандартных хроматографических пластинок;
увеличить чувствительность за счет обработки хроматограмм реактивом Драгендорфа, модифицированным 0,2%-ным водным раствором аскорбиновой кислоты, для осветления фона на хроматограмме.

Использование: в аналитической химии, в частности в способах определения пестицидов в сельскохозяйственной продукции и объектах внешней среды тонкослойной хроматографии, и может использоваться при контроле за содержанием в молоке и мясе N, n-дициклогексиламида сорбиновой кислоты (сорбамида), входящего в состав препаратов "Дарулан" и "Дицаваз". Сущность: определение микроколичеств сорбамида ведут на стандартных пластинках с тонким слоем сорбента, закрепленного крахмалом в подвижной фазе, состоящей из смеси четыреххлористого углерода и ацетона в объемном соотношении (20 15) : 1, с последующим обнаружением зоны локализации исследуемого вещества обработкой хроматограмм реактивом Драгендорфа, модифицированным 0,2%-ным водным раствором аскорбиновой кислоты.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДА В МОЛОКЕ И МЯСЕ, предусматривающий экстракцию пестицида из исследуемой пробы и выделенного из нее жирового остатка, очистку и концентрацию экстрактов с последующим их элюированием подвижным растворителем, нанесение пробы на пластинку с закрепленным на ней слоем сорбента, хроматографирование, проявление зон локализации искомого компонента путем обработки хроматограмм реактивом с последующим количественным определением искомого компонента по результатам визуального сравнения интенсивности окраски и размера пятен пробы с аналогичными характеристиками пятен стандартных растворов, отличающийся тем, что при определении остаточных количеств пестицида устанавливают микроколичества сорбамида, входящего в состав препаратов дарулан и дицаваз, при этом закрепление на пластинке слоя сорбента осуществляют крахмалом в подвижной фазе, в качестве последней используют смесь четыреххлористого углерода с ацетоном в объемном соотношении 20 15 1, а для обнаружения зон локализации сорбамида на хроматографических пластинках из ряда реактивов выбирают реактив Драгендорфа, модифицированный, 0,2%-ным водным раствором аскорбиновой кислоты.